Plataforma de imagem sem lentes implantável em campo para análise rápida e sem rótulos da ativação de células assassinas naturais
8 de agosto de 2025
Este protocolo descreve um método sem rótulo para a análise rápida de uma única célula da contagem e atividade de células natural killer (NK) usando a tecnologia de imagem de sombra sem lente. Este método quantifica as mudanças morfológicas em células NK individuais por meio de análise computadorizada de seus padrões de difração.
Nosso objetivo é avaliar rapidamente a função imunológica, quantificando a ativação das células NK em tempo real, usando imagens sem rótulos e sem lentes para aprimorar o monitoramento imunológico. Mostramos que o índice de imunidade inata, ou I3, distingue de forma confiável entre a atividade das células NK de doadores saudáveis e imunocomprometidos e se correlaciona fortemente com as citocinas e marcadores de citometria de fluxo. Os ensaios de células NK existentes requerem rótulos, instrumentos volumosos e longos tempos de incubação.
Nossa plataforma LSIT preenche essa lacuna, permitindo perfis rápidos, acessíveis e sem rótulos usando optoeletrônica simples. Nossa plataforma LSIT sem rótulo diferencia a ativação de células NK em um único nível de célula em 30 segundos usando parâmetros de sombra, eliminando a necessidade de coloração e citometria de fluxo dispendiosa. Estenderemos o LSIT para monitorar a ativação de células T e B e integrar algoritmos de aprendizado profundo para classificação de alto rendimento de diferentes estados de células imunes.
Para começar, remova os kits para isolamento de células natural killer, ou NK, da geladeira e deixe-os atingir a temperatura ambiente, entre 15 e 28 graus Celsius. Prepare o equipamento necessário colocando um separador magnético, pipetas com pontas estéreis e ajuste uma incubadora ou bloco de aquecimento para 37 graus Celsius. Usando uma pipeta, adicione 0,5 mililitros de sangue total ao tubo de reação com tampa verde contendo o coquetel de anticorpos.
Misture delicadamente o conteúdo pipetando para cima e para baixo no tubo cinco a seis vezes. Em seguida, incube o tubo por cinco minutos. Transfira todo o conteúdo do tubo com tampa verde para o tubo de separação com tampa vermelha usando uma pipeta e misture delicadamente pipetando o tubo cinco a seis vezes.
Coloque o tubo com tampa vermelha no separador magnético e incube em temperatura ambiente por 10 minutos. Enquanto mantém o ímã no lugar, use uma pipeta para transferir aproximadamente 1.5 mililitros do sobrenadante para o tubo de separação com tampa roxa dois. Misture delicadamente o conteúdo pipetando o tubo cinco a seis vezes.
Agora, coloque o tubo com tampa roxa no separador magnético e incube por 10 minutos. Enquanto o ímã ainda estiver no lugar, transfira aproximadamente 1 mililitro do sobrenadante para um tubo de recuperação com tampa cinza usando uma pipeta e misture cuidadosamente o conteúdo pipetando o tubo. Em seguida, adicione 100 microlitros da suspensão isolada de células assassinas naturais no tubo do veículo e outros 100 microlitros no coquetel estimulador de ativação, ou tubo ASC.
Misture delicadamente o conteúdo de ambos os tubos usando um misturador de vórtice para garantir uma distribuição uniforme. Incube os tubos no bloco de aquecimento ou incubadora ajustada a 37 graus Celsius por uma hora. Ligue a plataforma LSIT.
Inicie o software de captura LSIT. Faça login inserindo seu ID e senha e selecione Calibrar para iniciar o modo de calibração. Pressione o botão Abrir na tela sensível ao toque ou use o botão físico da porta deslizante para abrir a gaveta.
Quando a gaveta abrir, remova a corrediça de calibração e guarde-a. Agora, clique em Definir plano de fundo para calibrar a intensidade óptica. Recoloque a corrediça de calibração na gaveta e feche a gaveta.
Em seguida, clique em Iniciar calibração para concluir o processo. Remova uma lâmina de ensaio de sua bolsa. Rotule-o com os dados da amostra antes de colocá-lo em uma superfície limpa e plana.
Pipete 10 microlitros da amostra do veículo nos canais A e B e, em seguida, pipete 10 microlitros da amostra estimulada por ASC nos canais C e D. Agora, pressione Abrir para ejetar a gaveta. Remova a lâmina de calibração e coloque-a em uma caixa de armazenamento. Insira a corrediça de ensaio preparada na gaveta e pressione Fechar para prendê-la.
Volte ao menu principal e selecione NK Cell Activity and Test na tela principal. Insira o ID da amostra ou digitalize o código de barras para carregar o perfil da amostra. Em seguida, pressione Capturar para iniciar a gravação da imagem.
Após capturar a imagem, clique em Analisar para iniciar o processamento. Revise a porcentagem de atividade da célula NK e a contagem de células exibidas na tela. Baixe os resultados para uma unidade USB ou imprima-os usando o menu da tela sensível ao toque.
Selecione Contagem e teste de células na interface principal do LSIT. Carregue 10 microlitros da nova amostra em um novo canal de lâmina de ensaio usando uma pipeta. Insira a corrediça na gaveta.
Feche a gaveta usando a tela sensível ao toque ou o botão e insira o ID da amostra no sistema. Insira o fator de diluição na tela sensível ao toque, se aplicável, e pressione Contagem para iniciar a quantificação da célula. Visualize os resultados exibidos como células por microlitro na tela.
Após a análise, abra a gaveta pressionando o botão Abrir ou alternando a chave física. Remova a corrediça usada da gaveta usando as mãos enluvadas. Por fim, coloque a corrediça de calibração de volta na gaveta para proteger o sensor e feche a gaveta usando a tela sensível ao toque ou a chave seletora física.
A plataforma LSIT com software integrado avaliou quantitativamente a ativação das células NK comparando os valores de CSP das células de controle ativadas e não estimuladas. Ele forneceu ao relatório de imunidade uma tabela estatística resumida. A estimulação ASC induziu mudanças morfológicas claras nas células NK, incluindo aumento do tamanho e da complexidade citoplasmática, como visto em Citospins corados com Hema 3 após 30 minutos e duas horas.
As imagens de sombra mostraram que as células estimuladas por ASC tinham padrões de difração visivelmente mais complexos em comparação com os controles de veículos, com parâmetros extraídos indicando aumento da distância pico a pico, granularidade citoplasmática e parâmetro de sombra combinado. Os valores combinados dos parâmetros-sombra permitiram uma classificação clara entre doadores saudáveis e pacientes com câncer, com sobreposição mínima nas distribuições de células NK ativadas e não ativadas. Doadores saudáveis mostraram valores de índice de imunidade inata significativamente mais altos do que pacientes com câncer após estimulação ASC.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método isento de marcadores para a análise rápida de contagem e atividade de células assassinas naturais (NK) em nível de única célula, utilizando tecnologia de imagem de sombra sem lentes. Este método quantifica alterações morfológicas em células NK individuais por meio de análise computadorizada de seus padrões de difração.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Tecnologia de Imagem
Antecedentes
- Os ensaios atuais de células NK exigem marcadores e processos demorados.
- Os métodos existentes frequentemente envolvem instrumentos volumosos e longos tempos de incubação.
- Existe uma necessidade de técnicas rápidas e acessíveis para monitoramento imunológico.
- A imagem sem lentes pode aprimorar a avaliação da função imunológica.
Objetivo do Estudo
- Avaliar rapidamente a função imunológica mediante a quantificação da ativação de células NK em tempo real.
- Fornecer um método livre de marcadores para o perfilhamento de células NK.
- Diferenciar a atividade de células NK entre doadores saudáveis e imunocomprometidos.
Métodos Utilizados
- Tecnologia de imagem sem lente por projeção (LSIT).
- Análise computadorizada de padrões de difração.
- Monitoramento em tempo real da ativação de células NK.
- Integração de algoritmos de aprendizado profundo para classificação de estados de células imunes.
Resultados Principais
- O LSIT diferencia a ativação de células NK em nível de única célula dentro de 30 segundos.
- O índice de imunidade inata (I3) correlaciona-se com citocinas e marcadores de citometria de fluxo.
- A eliminação da coloração e da citometria de fluxo, que é onerosa, aumenta a eficiência.
- Potencial para ampliar o LSIT no monitoramento da ativação de células T e B.
Conclusões
- A plataforma LSIT oferece um método de perfilamento rápido, acessível e sem marcadores.
- Este método aprimora as capacidades de monitoramento imunológico.
- Aplicações futuras podem incluir a classificação em alto rendimento de diferentes estados de células imunes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Quantificação rápida e livre de marcadores da ativação de células NK usando tecnologia de imagem por sombra sem lente (LSIT) resolve um gargalo crítico na avaliação da função imunológica para pesquisas translacionais e pré-clínicas. Ao permitir o perfilamento imunológico quantitativo em tempo real, sem necessidade de coloração ou citometria de fluxo, esta plataforma aumenta a confiança preditiva e a eficiência operacional em pontos cruciais de descoberta e validação. A abordagem possibilita o monitoramento imunológico em larga escala, facilitando decisões de portfólio ajustadas ao risco em P&D orientado pela imunologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a análise quantitativa da ativação de células NK como parâmetro funcional imunológico.
- Apoia a redução de riscos biológicos ao distinguir respostas de doadores saudáveis de doadores imunocomprometidos.
- Fornece dados rápidos e sem marcação para orientar a validação de alvos e estudos mecanicistas.
- Facilita a previsão confiável do envolvimento de vias imunológicas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece métricas padronizadas e reprodutíveis de ativação em nível de célula única, adequadas para o desenvolvimento de ensaios.
- Reduz o tempo de análise do ensaio ao eliminar a coloração e a utilização de instrumentação complexa.
- Permite o perfilhamento de alta produtividade de células imunes para fluxos de trabalho de triagem de compostos.
- Oferece suporte à escalabilidade e reutilização da plataforma em diferentes tipos de células imunes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha métricas de ativação imunológica com desfechos funcionais relevantes para a doença.
- Proporciona continuidade desde a descoberta até o monitoramento imunológico pré-clínico.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base na função imunológica quantitativa.
- Apoia o desenvolvimento de biomarcadores translacionais para a imunidade inata.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A plataforma LSIT se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao fornecer dados rápidos e quantitativos de ativação de células imunes que orientam tanto a validação inicial de alvos quanto a pesquisa translacional subsequente.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias por meio da medição em tempo real da ativação de células NK.
- Triagem: Oferece resultados quantitativos e reprodutíveis para a preparação de ensaios baseados em células imunes.
- Análise: Fornece resultados estatísticos, como o índice de imunidade inata (I3) e o parâmetro combinado de sombra (CSP), para comparação robusta entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas e validação pré-clínica com perfilhamento imune relevante para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma escalável e livre de marcadores, adaptável a outros tipos de células imunes e ensaios funcionais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na avaliação da função imunológica.
- Valor Operacional: Otimiza fluxos de trabalho por meio da padronização, tempo reduzido de análise e mínima preparação de amostras.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais rápidas de prosseguir/não prosseguir e melhora a eficiência de capital ao reduzir a dependência de ensaios que consomem muita mão de obra.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos com foco em imunologia.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em isolamento de células imunes e análise quantitativa de imagens.
- Depende do acesso a instrumentação LSIT e software integrado de análise.
- Exige padronização entre equipes para manipulação de amostras e interpretação de dados.
- Adaptável a diversos tipos de células imunes mediante otimização do protocolo.
- Limitado pela necessidade de ativadores proprietários e reagentes específicos da plataforma.
