Uma análise R poderosa e fácil de usar de conjuntos de dados em grande escala

Nosso objetivo é entender a base molecular subjacente a como as plantas se defendem de seus patógenos e, em última análise, usar esse conhecimento para melhorar a saúde das plantas e o rendimento das culturas. Grandes conjuntos de dados podem ser relativamente facilmente gerados em um campo biológico, porém, analisar esses conjuntos de dados maiores de forma oportuna pode ser desafiador. Para começar, adicione as sementes a um tubo microcentrífuga com três furos no topo e coloque o tubo dentro de um sino de jar.

Depois, gerar vapor de água sanitária adicionando três mililitros de ácido clorídrico a 36% de ácido sanitário doméstico em um béquer dentro de uma exaustora de fumaça. Coloque o béquer no vaso de cristal e deixe-o em uma exaustão química por três horas. Após a esterilização, usando uma pipeta pasteura de vidro estéril, coloque as sementes em placas de médio Murashige e Skoog contendo 0,5% de sacarose e 0,8% de parafuso dentro de um armário de fluxo laminar.

Coloque as placas Murashige e Skoog blindadas e seladas em um ambiente a quatro graus Celsius por dois dias antes de movê-las para uma câmara de cultura de tecidos ajustada para um ciclo de luz de 12 horas e um ciclo de escuridão de 12 horas. Depois, transfira as mudas para uma placa de 96 poços, garantindo que cada poço contenha 180 microlitros de meio de ensaio. Cubra a placa com filme transparente e faça dois furos por poço para aeração.

Coloque as placas por um dia sob ciclos de luz de 12 horas e ciclos de escuridão de 12 horas, seguido por um dia sob 24 horas de luz constante. Adicione tratamentos ou simulações de solução em cada poço. Depois, registre as leituras de luminescência sob condições de luz constante com o ganho da lente do filtro de emissão ajustado para 3.600 e o intervalo de medição definido para um segundo, iniciando a aquisição dos dados.

Ao final da gravação de luminescência, tire uma fotografia da placa de 96 poços para documentar o crescimento da muda. Observe as curvas de dados do ensaio de luminescência para confirmar a consistência do tratamento e salve os dados brutos de luminescência como um arquivo CSV para análise R posterior usando a função salvar como no software de análise de dados do leitor de placas. Após instalar o software RStudio e os pacotes algorítmicos necessários, selecione o diretório de trabalho onde o arquivo de entrada está armazenado, que também servirá como pasta de saída para os resultados.

Depois, selecione o arquivo de entrada CSV formatado corretamente. Certifique-se de que a linha superior contenha pontos de tempo e que a primeira coluna liste as posições individuais das amostras na placa de 96 poços. Nomeie as amostras e tratamentos de acordo com o layout de 96 poços, garantindo que o projeto inclua oito réplicas por tratamento com até 12 tratamentos, ou 12 réplicas por tratamento com até oito tratamentos.

Se alguma linha ou coluna estiver vazia, atribua nomes como Empty1, Empty2, e assim por diante à lista de etiquetas de tratamento. Depois, indique o tempo relativo de início do ensaio de luciferase com base no momento de início da luz na câmara. Modificar a seção User Input II para atender necessidades específicas de análise.

Incluir geração de grafos para curvas de luminescência e para comparações de período, fase e amplitude entre genótipos e tratamentos. Use o teste ANOVA com o teste de diferença significativa honesta de Tukey para comparar tratamentos com base em período, fase e amplitude. Escolha um tratamento controle para a saída da análise ou deixe o campo de controle vazio para comparar todos os tratamentos em pares.

Opcionalmente, numere os arquivos de saída da análise para facilitar a referência e organização. Agora, use um teste t para comparar tratamentos com base no período, fase e amplitude. Escolha se o teste t deve ser realizado como uma comparação par a par e, em caso afirmativo, especifique se os dados são pareados.

Escolha se arredonda os pontos de tempo no conjunto de dados. Se os valores de tempo variarem apenas por alguns minutos, arredonda-os para a hora mais próxima antes de prosseguir com a análise. Agora, defina o formato de entrada para identificação de poços com base em como o leitor de placas exporta os dados.

Escolha entre o formato padrão, onde os poços são listados por A1, A2, A3, e assim por diante, ou o formato alternativo, onde os poços são listados por A1, B1, C1, etc. Depois, execute a análise de dados da luciferase clicando no botão Source localizado no canto superior direito do console RStudio. Veja a saída da análise na pasta designada, que contém documentos e subpastas resumindo as estatísticas médias de período, fase e amplitude para cada genótipo e tratamento.

Usando uma biópsia, corte discos foliares de quatro milímetros de diâmetro das folhas da quarta à sétima folhas de plantas de 25 dias. Flutue os discos da folha com o lado peludo voltado para cima em 100 microlitros de água estéril dentro de uma placa de 96 poços. Cubra a placa de 96 poços com papel alumínio limpo e coloque-a em uma câmara de crescimento clara e escura durante a noite.

Depois, remova a placa e substitua a água estéril por 100 microlitros de solução de luminol. Comece imediatamente a gravar a luminescência a cada minuto por 40 a 60 minutos. Após baixar os pacotes RStudio necessários, selecione o diretório de trabalho.

Selecione o arquivo de entrada, garantindo que seja um arquivo CSV corretamente formatado. A linha superior deve incluir dados de séries temporais, e a primeira coluna deve conter as posições das amostras em uma placa de 96 poços. Nomeie as amostras e tratamentos de acordo com a disposição das placas, conforme descrito anteriormente.

Rotule poços vazios explicitamente como Empty1, Empty2, e assim por diante. Use o teste ANOVA com a diferença significativa honesta de Tukey para comparar somas totais de luminescência entre os tratamentos. Use um teste t bilateral ao comparar dados de apenas dois tratamentos ao mesmo tempo.

Gerar resultados gráficos incluindo curvas de fluorescência e um gráfico de barras mostrando a soma total de luminescência entre os tratamentos. Adicione desvio padrão ou erro padrão da média às barras plotadas. Ajuste o formato de leitura de entrada com base em como o leitor de placas fornece identificadores de poços.

Escolha entre listagem padrão por A1, A2, A3 ou listagem vertical por A1, B1, C1.To execute a análise, clique no botão Fonte localizado no canto superior direito do console RStudio. Veja a saída na pasta gerada, que contém múltiplos documentos e subpastas resumindo a análise completa. O ensaio de luciferase foi realizado usando uma linha transgênica que expressava o repórter de luciferase CCA1 e sete linhas transgênicas transformadas independentemente expressando o repórter de luciferase GRP7.

Os vestígios de luminescência dessas plantas foram medidos ao longo de 168 horas. Usando o método R, parâmetros de clock calculados para o repórter da luciferase CCA1 foram obtidos com uma amplitude de 3.000 unidades relativas de luminescência por segundo por muda, um período de 23,5 horas e uma fase de 3,5 horas. Todas as linhas de luciferase pGRP7 apresentaram valores de período e fase semelhantes, mas variaram em amplitude.

O período de luciferase pGRP7 é de 24,2 horas, enquanto a fase é de 12 horas. Para validar ainda mais a análise R, o mesmo conjunto de dados foi reanalisado usando o BioDare2, uma plataforma online gratuita para análise de dados circadianos 8, e resultados semelhantes foram obtidos. Os dados circadianos gerados com células do sistema operacional U2 expressando o repórter Per2dLuc foram reanalisados usando o método R.

O grupo controle apresentou uma amplitude de 184,8 unidades relativas de luminescência, um período de 23,3 horas e uma fase de 2,8 horas. A redução do CRY2, mas não do PSMD4 e do PSMD7, afetou significativamente os parâmetros circadianos, amplitude, fase e período. Esses resultados foram consistentes com os resultados publicados.

Nossa pesquisa revelou que o relógio circadiano é importante para a defesa planejada contra patógenos. Temos usado rotineiramente o protocolo descrito aqui para analisar conjuntos de dados de séries temporais em grande escala, tanto de ensaios de clock quanto de defesa. Nosso protocolo usando scripts R no RStudio oferece uma ferramenta amigável e conveniente para pesquisadores que trabalham com grandes séries temporais.

Nosso protocolo, fácil de usar, tem múltiplas opções estatísticas e permite que um iniciante sem conhecimento prévio de R ou experiência em programação o utilize.