Name: Detecção de DNA no local de parasitas tripanossomatídeos e Nosema ceranae por meio de lise alcalina acoplada ao sistema RPA/CRISPR/Cas12a (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprenda a detectar patógenos de abelhas usando RPA e CRISPR/Cas12a com lise alcalina. Este método isotérmico oferece diagnóstico rápido, sensível e portátil para Lotmaria passim e Nosema ceranae em campo.

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<ol><li>Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bee+declines+driven+by+combined+stress+from+parasites%2C+pesticides%2C+and+lack+of+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers.</a> Science. 347 (6229), 1255957(2015).</li>
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<li>Aman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iSCAN-V2%3A+a+one-pot+RT-RPA-CRISPR%2FCas12b+assay+for+point-of-care+SARS-CoV-2+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">iSCAN-V2: a one-pot RT-RPA-CRISPR/Cas12b assay for point-of-care SARS-CoV-2 detection.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 800104(2022).</li>
<li>Peng, R., Lu, Z., Liu, M., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-RPA-assisted+CRISPR%2FCas12a+for+rapid+and+multiplex+detection+of+respiratory+infectious+viruses+based+on+centrifugal+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-RPA-assisted CRISPR/Cas12a for rapid and multiplex detection of respiratory infectious viruses based on centrifugal microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 399, 134838(2024).</li>
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<li>Hao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+lyophilized+CRISPR%2FCas12a+and+RPA+assay+for+rapid+detection+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem+J%22%5BJournal%5D)">Application of a lyophilized CRISPR/Cas12a and RPA assay for rapid detection of Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Microchem J. 206, 111443(2024).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+all-in-one+RPA-Cas12a+strategy+with+de+novo+autodesigner+and+its+application+in+on-site+ultrasensitive+detection+of+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A universal all-in-one RPA-Cas12a strategy with de novo autodesigner and its application in on-site ultrasensitive detection of DNA and RNA viruses.</a> Biosens Bioelectron. 239, 115609(2023).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6641">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68871">10.3791/68874</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68874">On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

<table><tbody><tr><td>0,2 mL de tubos Eppendorf livres de DNAse e RNAse</td><td>Axygen</td><td>MTC-02-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf livres de DNAse e RNAse de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MTC-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L pontas filtradas de baixa retenção</td><td>Clínicas de laboratório</td><td>5-063-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L pontas filtradas de baixa retenção</td><td>Clínicas de laboratório</td><td>5-120-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L pontas filtradas de baixa retenção</td><td>Clínicas de laboratório</td><td>5-203-P4-0</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de bloco seco Stuart série BH-200</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-36610-00</td><td></td></tr><tr><td>Água tratada com DEPC</td><td>Ambicon</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>EnGen Lba Cas12a (Cpf1)</td><td>Biolabs da Nova Inglaterra</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Pilões de microtubos</td><td>Marca de pescador</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>Milenia GenLine HybriDetect</td><td>Milênia</td><td>MGHD 1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>RPA kit TwistAmp Liquid Basic</td><td>Amplificador de torção</td><td>&nbsp; TALQBAS01</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi</td><td>Swann-Morton</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Chanel Única PIPETMAN P1000L Micropipeta Ejetagem de metal</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Chanel única PIPETMAN P100L Micropipeta Ejete de metal</td><td>Gilson</td><td>F144057M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Chanel Única PIPETMAN P10L Micropipeta Ejetagem de metal</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito de sódio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de detecção de PCR em tempo real por toque</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp Líquido Básico</td><td>Torcer</td><td>TALQBAS01</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de dna no local de parasitas tripanossomatídeos e nosema ceranae por meio de lise alcalina acoplada ao sistema rpa/crispr/cas12a

On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

Aqui, descrevemos um método rápido no local usando lise alcalina de abdômen de abelhas operárias acoplado à amplificação de RPA e detecção baseada em CRISPR / Cas12a por abordagens de fluorescência e / ou fluxo lateral. O esquema do fluxo de trabalho completo é representado na Figura 3, e o esquema da lise alcalina HotSHOT do abdômen das abelhas operárias está na Figura 4. Os resultados representativos do ensaio RPA/CRISPR/Cas12a são mostrados na Figura 5. Para detectar L. passim e N. ceranae, um termociclador foi usado para quantificar as unidades de fluorescência relativa (RFUs) usando uma sonda marcada com FAM (Figura 4A). As reações de RPA foram realizadas usando 10 ng de DNA, e os dados de fluorescência foram plotados em um gráfico (Figura 4B). Na etapa final do ensaio, amostras em tubos cônicos foram fotografadas usando um sistema de imagem em gel (Figura 4C). Para detecção com sonda marcada com biotina, as amostras foram incubadas em termobloco (Figura 4A); a solução de detecção foi preparada de acordo com as instruções do fabricante e aplicada em uma faixa de fluxo lateral (Figura 4B, C). O método resultou em uma detecção bem-sucedida de ambos os patógenos das abelhas.
Para determinar a eficiência das reações de RPA, comparamos esse método com qPCR padrão usando DNA purificado de abelhas usando o kit referenciado (consulte a Tabela de Materiais). Um total de 32 amostras de abelhas foram testadas com primers direcionados ao gene da β-tubulina de L. passim para ambos os métodos e, em seguida, detectadas por transclivagem CRISPR/Cas12a de sondas fluorescentes. Notavelmente, como resultado, 12 amostras foram consideradas positivas por qPCR, enquanto RPA/CRISPR/Cas12a detectou L. passim em 16 amostras (Figura 5A). Isso indica que o desempenho da reação RPA é mais sensível do que o PCR, como o método de amplificação de DNA padrão-ouro.
Da mesma forma, determinamos o limite de detecção (LOD) para qPCR e RPA acoplado à detecção de CRISPR/Cas12a para DNA de L. passim como modelo de patógeno usando diluições seriadas de DNA de L. passim variando de 66 ng a 6 fg. qPCR detectou apenas 6 pg, correspondendo a aproximadamente 96 parasitas (Figura 5B). Em comparação, o LOD para RPA correspondeu a 96 parasitas (Figura 5C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig1.jpg"> 
Figura 1: Fluxo de trabalho geral da lise alcalina HotSHOT juntamente com amplificação de RPA e métodos de detecção de Cas12 em abelhas. Abreviaturas: RPA = amplificação da polimerase recombinase; CRISPR = repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas; Cas = proteína associada a CRISPR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig2.jpg"> 
Figura 2: Processamento de lise celular pronta para amplificação com tampão HotSHOT. (A) Corte o abdômen da abelha com um bisturi e coloque-o em um tubo de centrífuga; (B) com um pilão, fazer uma maceração com 400 μL de HotShot; (C) incubar em um termobloco a 95 °C por 10 min; e (D) neutralizar com 400 μL de Tris-HCl 40 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig3.jpg"> 
Figura 3: Fluxo de trabalho geral para a preparação da enzima Cas12a e soluções de sonda repórter marcadas com FAM e biotina. Abreviaturas: DEPC-água = água tratada com dietil pirocarbonato; crRNA= RNA CRISPR; Cas12 = tipo de proteína associada a CRISPR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig4.jpg"> 
Figura 4: Detecção de Lotmaria passim e Nosema ceranae. pelo método CRISPR/Cas12a com sondas FAM e biotina. Para detecção de FAM, (A) as amostras estão sendo incubadas em um termociclador; (B) as unidades de fluorescência relativas (RFU's) de L. passim e N.ceranae; (C) visualização das mesmas amostras em um sistema de fotodocumentação. Nos testes de biotina, (a) uma amostra incubada em um bloco térmico; (b) amostras foram adicionadas em uma fita imunológica do kit (consulte a Tabela de Materiais); c) Os resultados após a incubação. Abreviaturas: LP= Lotmaria passim; NC= Nosema ceranae; NTC= sem controle de modelo; RFU: unidades de fluorescência relativa <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig5.jpg"> 
Figura 5: Comparação entre qPCR e RPA, e limite de detecção de Lotmaria passim. (A) Detecção de L. passim em amostras de abelhas usando qPCR convencional e RPA. (B) limite de detecção de qPCR de L. passim usando SsoFast EvaGreen. (C) Limite de detecção de L. passim usando CRISPR/Cas12a com uma sonda marcada com FAM; (D) visualização da mesma detecção CRISPR/Cas12a (de C) sob um sistema de imagem de gel (linha superior) e resultados de fluxo lateral correspondentes usando CRISPR/Cas12a com uma sonda marcada com biotina (linha inferior). Abreviaturas: RPA = amplificação da polimerase recombinase; qPCR= reacção em cadeia da polimerase quantitativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Concentração Final</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x tampão de reação</td>
			<td>1x</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>1,8 mM</td>
			<td>1,8 μL</td>
			<td>9 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x E-Mix Básico</td>
			<td>1x</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer direto (10 μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer reverso (10 μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Mistura de Reação do Núcleo</td>
			<td>1x</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Água DEPC</td>
			<td>--</td>
			<td>0,7 μL</td>
			<td>3,7 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Componentes Mastermix para RPA com volumes finais de 10 μL e 50 μL e concentrações de trabalho correspondentes:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Concentração final</td>
			<td>Reação de 10 μL</td>
			<td>Reação de 50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>280 mM MgOAc</td>
			<td>1,8 mM</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADN</td>
			<td>10-0,1 ng</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Quadro 2: Volume de reagentes a adicionar por amostra numa reação de RPA
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>[estoque]</td>
			<td>[final]</td>
			<td>1x (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzima Cas12a</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>de cRNA</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonda FAM</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampão NEB 10x</td>
			<td>10x</td>
			<td>1x</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicon RPA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Água</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>32.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Concentrações de reagentes para fazer uma mistura de detecção FAM pelo método CRISPR/Cas 12a. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>[estoque]</td>
			<td>[final]</td>
			<td>1x (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzima Cas12a</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>de cRNA</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonda de biotina</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>500 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampão NEB 10x</td>
			<td>10X</td>
			<td>1X</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicon RPA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Água</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Concentrações de reagentes para fazer uma mistura de detecção de biotina pelo método CRISPR/Cas 12a.

Detecção de DNA no local de parasitas tripanossomatídeos e Nosema ceranae por meio de lise alcalina acoplada ao sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Early on-site detection of microscopic pathogens is essential for the effective management and health of honeybee colonies. Currently, the gold standard ...

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Biologia

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Detecção indel seguindo CRISPR/Cas9 Mutagenesis usando análise de derretimento de alta resolução no mosquito Aedes aegypti

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Detecção de DNA no local de parasitas tripanossomatídeos e Nosema ceranae por meio de lise alcalina acoplada ao sistema RPA/CRISPR/Cas12a

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