Avaliando o efeito dos fatores SASP na proliferação de células cancerígenas usando uma análise comparativa de três metodologias distintas

Células cancerígenas senescentes secretam fatores que influenciam células vizinhas. Apresentamos três modelos in vitro para estudar efeitos paracrinos e justacrinos impulsionados por SASP na proliferação celular HeLa, monitoramento de impedância em tempo real e análise dinâmica, cinética e morfológica permitida por imagens de células vivas, revelando efeitos paracrinos senescentes e microambientais além dos ensaios finais tradicionais. Para começar, ligue o sistema de análise de células em tempo real antes da semeadura das células.

Inicie o software RTCA versão 2.0. Clique no botão X Notes e insira os detalhes experimentais. Clique no botão Agendar e adicione dois passos para registrar o fundo e monitorar a proliferação celular a cada 15 minutos durante 72 horas.

Escolha o primeiro passo e clique em Play. Adicione manualmente 50 microlitros de meio completo a cada poço da visão da placa elétrica. Em seguida, lave as células HeLa senescentes e não senescentes com cinco mililitros de PBS estéril e pré-aquecido.

Após aspirar, adicione um mililitro de tripsina pré-aquecida a 0,05% e incube. Neutralize a tripsina com cinco mililitros de DMEM completo suplementado com antibiótico. Depois, centrifuge as células a 500 G em temperatura ambiente por 10 minutos.

Após descartar o sobrenadante, re-suspenda os pellets celulares em cinco mililitros de DMEM completo suplementado com antibiótico. Agora, seme células HeLa não senescentes em cada poço de uma visão de placa e-plate em 100 microlitros de DMEM completo suplementado com antibióticos. Coloque a visão da placa e-plate no suporte do sistema de análise celular em tempo real para permitir que as células se fixem à superfície da placa na incubadora.

Escolha o segundo passo e clique em Play para iniciar a medição de impedância. Células semente na placa e-plate inserem poços contendo 60 microlitros de DMEM completo suplementado com antibióticos sob três diferentes configurações experimentais. Mantenha o inserto da placa e-plate a 37 graus Celsius em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono por seis horas para fixação.

Clique em Pausar após seis horas de semeadura celular, depois aspire suavemente o meio de cultivo de cada poço da visão da placa e-plate para remover as células séricas e não aderentes. Lave poços duas vezes com PBS pré-aquecido a 37 graus Celsius. Adicione 140 microlitros de DMEM sem soro a cada poço da visão da placa elétrica.

Remova o médio. Lave poços do inserto e-plate com PBS, depois adicione 60 microlitros de DMEM sem soro. Agora, posicione o inserto da placa E na visão da placa E.

Pressione suavemente até que o insert esteja totalmente semeado no poço. Insira a placa combinada no sistema de análise celular em tempo real. Clique em Play para retomar o monitoramento em tempo real dos valores do índice das células em intervalos de 15 minutos usando o software.

Normalize os valores do índice de células no momento em que a visualização da placa e o inserto da placa e da placa e são combinados e inseridos no sistema de análise de células em tempo real. Em seguida, pressione o botão de Análise de Dados para calcular a taxa e quantidade de proliferação usando os dados máximos de índice e inclinação da célula obtidos do sistema de análise celular em tempo real. Depois, analise os dados usando um programa estatístico apropriado.

Aspire o meio de cultura de ambas as placas de seis poços contendo as células HeLa senescentes e não senescentes. Lave as células duas vezes com PBS pré-aquecido a 37 graus Celsius para remover resíduos séricos e detritos celulares. Adicione dois mililitros de mídia DMEM suplementada com antibióticos sem soro em cada poço, depois incube as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas.

Reúna o meio condicionado de cada poço em tubos estéreis em um armário de segurança laminar. Centrifugar o meio condicionado coletado a 1000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius para remover detritos celulares, seguido por centrifugação a 10.000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius para obter o sobrenadante clarificado. Em seguida, centrifuge o meio condicionado usando unidades de filtro ultracentrífugo de dois mililitros a quatro graus Celsius por 60 minutos a 3000 g para concentrá-lo a 400 microlitros.

Dilua o concentrado obtido com meio fresco sem soro para preparar meios condicionados concentrados 1x, 2x e 3x em tubos estéreis em uma cabine de segurança laminar. Quando as células se ligarem, aspire suavemente o meio de cultivo de cada poço da visão da placa e-plate para remover células séricas e não aderentes e lave com PBS. Em seguida, pipetei 200 microlitros pré-aquecidos os meios condicionados coletados a 37 graus Celsius em cada grupo.

Insira a visualização da e-plate no sistema de análise celular em tempo real e clique em Play para retomar o monitoramento em tempo real dos valores do índice celular em intervalos de 15 minutos por 48 horas. As células de semente sobre uma microlâmina sob três configurações experimentais e incubam a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono. Após oito horas de fixação, lave as células duas vezes com PBS pré-aquecido a 37 graus Celsius.

Adicione 200 microlitros de Dulbecco's Modified Eagle's Medium sem sérum em cada poço. Ligue o controlador de temperatura 2002-2 e ajuste para 37 graus Celsius. Ligue o CO2-Controller 2000 e ajuste para 5% de dióxido de carbono.

Ligue a fonte de luz fluorescente. Coloque o slide na câmara de incubação no topo do palco. Inicie o software no computador.

Selecione o objetivo 20x. Adicione o canal de contraste de fase e o canal FITC de fluorescência. Usando o controlador de palco, marque as posições de cada local.

Defina o intervalo de tempo para 30 minutos e a duração da aquisição para 48 horas, então inicie a aquisição. Conte células positivas para proteínas fluorescentes verdes em ambos os pontos temporais e calcule o aumento percentual para análise. O tratamento com Doxorrubicina induziu significativamente senescência celular nas células HeLa.

A quantificação das células SA-beta-gal-positivas mostrou uma porcentagem significativamente maior no grupo tratado com doxorubicina em comparação ao controle. Na primeira abordagem, células HeLa não senescentes, co-cultivadas com células Senescentes, apresentaram uma taxa e capacidade de proliferação significativamente aumentadas em comparação com células co-cultivadas com células HeLa não senescentes. Meios condicionados derivados de células HeLa senescentes em concentrações 2x e 3x aumentaram significativamente a taxa e capacidade de proliferação das células HeLa não senescentes em comparação com meios condicionados de células não senescentes.

Na terceira abordagem, após 48 horas de co-cultura, as células HeLa positivas para GFP apresentaram um aumento significativamente maior na proliferação quando co-cultivadas com células Senescentes de HeLa em comparação com co-culturas não senescentes ou controles apenas com GFP.