Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

Estudamos como células em divisão transmitem fielmente seus cromossomos durante a mitose, focando nas máquinas moleculares e nos mecanismos que garantem a segregação precisa dos cromossomos. Sincronizamos células para estudar processos moleculares que mudam conforme o ciclo celular. Sem esses métodos, as mudanças chave estariam ocultas em uma população celular não sincronizada.

Comparado a outros métodos de sincronização, a parada por fator alfa em mutantes BAR1 proporciona uma parada G1 mais limpa e reversível, permitindo acompanhar toda a cultura de levedura progredindo de forma síncrona ao longo do ciclo. Nosso trabalho revela mudanças dinâmicas na localização e atividade das proteínas ao longo do ciclo celular, lançando luz sobre processos mitóticos chave, como segregação cromossômica e manutenção do fuso. Para começar, inocule a levedura em 25 mililitros de meio YPAD e incube durante a noite para atingir uma densidade óptica de 600 nanômetros entre 0,5 e 2,0.

Dilua as células da levedura até uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,5. Adicione fator alfa à cultura para atingir a concentração final de um micrograma por mililitro. De 2,5 a 3,5 horas após a adição do fator alfa, conte a porcentagem de células shmooed não brotadas ao microscópio para avaliar a parada celular.

Depois, centrifuge a cultura em uma centrífuga a 3.000g por três a cinco minutos a 23 graus Celsius. Despeje cuidadosamente o sobrenadante para remover o fator alfa. Ressuspenda o pellet celular em 25 mililitros de YPAD contendo 1% de dimetil sulfóxido para lavar as células.

Transfira o pellet de células para um tubo novo e repita as lavagens mais duas vezes, totalizando três lavagens para remover qualquer fator alfa residual. Em seguida, adicione YPAD às células lavadas para levar o volume final a 25 mililitros e transfira a suspensão para um novo frasco para incubação ou uso posterior. Colete a amostra de ponto de tempo de zero minutos imediatamente após a liberação e fixe a amostra.

Aos 60 minutos após a liberação, avalie a sincronia da população celular sob um microscópio óptico. Se desejado, adicione o fator alfa novamente aos 60 minutos após a liberação até uma concentração final de um micrograma por mililitro para bloquear a progressão para o próximo ciclo celular. Continue coletando amostras de pontos de tempo a cada 15 minutos até 180 minutos ou pelo tempo que for necessário.

Para fixar as células da levedura, centrifuge um mililitro de cultura por um minuto na velocidade máxima. Aspire completamente o sobrenadante. Depois, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de solução fixadora e incube a 23 graus Celsius por dois a 15 minutos.

Após centrifugar as células fixas, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão fosfato de potássio 0,1 molar no pH 6,4. Antes da imagem, centrifuge as células fixas a 23 graus Celsius por um minuto na velocidade máxima. Após o sobrenadante ser aspirado, ressuspenda o pellet em 10 a 100 microlitros de solução Triton, DAPI e sorbitol.

Pipete aproximadamente 0,8 microlitros da suspensão de célula manchada diretamente no centro de uma cobertura limpa. Use a ponta de uma pipeta para espalhar suavemente a gota em uma área circular de aproximadamente um centímetro quadrado de tamanho. Coloque a capa sobre uma lâmina de microscopia.

Usando um Kimwipe, pressione suavemente ao redor das bordas da capa para distribuir a amostra de forma uniforme. Depois, sele as bordas da capa com esmalte para fixar a amostra. Leve a lâmina preparada a um microscópio equipado com ampliação de 60 vezes, objetivo de imersão em óleo com abertura numérica de 1,42 e conjunto de laser e filtro vermelho, verde, azul e vermelho distante.

Foque o microscópio nas células de levedura aderidas ao revestimento. Uma vez focado, ajuste as configurações de exposição para cada canal de fluorescência para alcançar uma relação sinal-ruído de pelo menos três para um. Ajuste as configurações de aquisição para coletar de 14 a 20 imagens do z-stack, com cada fatia espaçada 0,2 micrômetros de distância, cobrindo uma profundidade z total de dois a quatro micrômetros.

Em microscópios equipados com módulos de pós-processamento, selecione as opções de Deconvolução e Projeção Rápida para cada imagem do z-stack. Adquira z-stacks da amostra, capturando imagens suficientes para registrar aproximadamente de 100 a 200 células de levedura para cada condição experimental ou ponto de tempo. Para análise, abra as imagens projetadas no software ImageJ.

Ajuste o brilho e o contraste de cada canal de fluorescência para aumentar a visibilidade. Para analisar a progressão do ciclo celular, conte 100 células para cada ponto de tempo e classifique-as como contendo um ou dois núcleos. Para calcular a porcentagem de células que apresentam pontos Stu2-GFP, padronize as configurações de brilho do canal verde em todas as imagens.

Células de contagem que mostram pontos Stu2-GFP que co-localizam com Spc110-mCherry puncta como positivos para localização de cinetocores. Em seguida, para quantificar a intensidade dos pontos proteicos, use a ferramenta de seleção livre para delinear a região de interesse ao redor do sinal. Adicione a seleção ao Gerenciador de Região de Interesse pressionando T ou escolhendo a opção no menu do Gerente de ROI.

No Gerenciador de ROI, clique em Medir para calcular a intensidade do ponto. Para visualizar as mudanças ao longo do tempo, plote a intensidade média com intervalos de confiança de 95% para cada ponto de tempo. Conte aproximadamente 100 células por condição.

Em células detidas por G1, Stu2-GFP localizou-se em um único ponto proximal do polo fuso com sinal adicional disperso ao longo dos microtúbulos citoplasmáticos. Aos 60 minutos após o lançamento, o Stu2-GFP se localizou como dois pontos adjacentes a polos duplicados do fuso marcados por Spc110-mCherry. Aos 90 minutos, durante a anáfase, o Stu2-GFP apareceu tanto próximo aos polos do fuso quanto ao longo dos microtúbulos que atravessam o eixo único.

Após a saída mitótica, aos 120 minutos, o Stu2-GFP reapareceu nos microtúbulos astrais no citoplasma. A quantificação revelou que a intensidade do Stu2-GFP próximo aos polos do fuso aumentou durante a mitose inicial, atingindo o pico antes da anáfase e diminuindo posteriormente. A porcentagem de células binucleadas atingiu o pico de aproximadamente 90 minutos, indicando entrada sincronizada na anafase.