Revelando o controle eletromecânico da homeostase tecidual usando um dispositivo microfluídico de duas camadas

Aplicamos campos elétricos controlados para estudar como os tecidos respondem a pistas elétricas, com foco em como as correntes ou campos regulam a adesão, proliferação e extrusão celular, impactando a homeostase do tecido. Descobrimos que a direção das correntes fisiologicamente relevantes dita os estados dos tecidos. O campo apical a basal induziu um fenótipo proliferativo, enquanto o campo basal a apical promove a extrusão celular, permitindo a modulação da densidade celular geral.

Embora os estudos bioelétricos quantitativos tenham se concentrado na migração via gravitaxis, a homeostase tecidual permanece inacessível. Nosso sistema agora permite a investigação direta de como as caixas fisiológicas regulam a organização e a manutenção dos tecidos. Nosso protocolo integra microfluídica, estimulação elétrica de tecidos, microscopia de estrutura e força e imagens ao vivo para estudar o controle eletromecânico da homeostase tecidual.

Nosso trabalho revelou as principais regras de acoplamento eletromecânico. Com novas ferramentas, agora podemos explorar como os padrões bioelétricos nativos emergem e regulam os tecidos e se podemos controlar o comportamento complexo do tecido ajustando essas pistas eletromecânicas. Para começar, coloque uma camada limpa de polidimetilsiloxano, ou molde PDMS, voltada para cima em uma tampa de prato de plástico limpa e adicione 500 microlitros de adesivo líquido curável por ultravioleta lentamente no molde.

Usando uma espátula, molhe cuidadosamente todas as estruturas salientes e remova quaisquer bolhas de ar formadas durante o processo de umedecimento. Pressione suavemente uma lamínula no molde PDMS e use um limpador de laboratório para remover qualquer excesso de adesivo curável ultravioleta, garantindo que a parte superior da lamínula permaneça limpa e plana. Cure a estrutura parcialmente sob luz ultravioleta uniformemente iluminada com um comprimento de onda entre 363 e 370 nanômetros.

Limpe todas as marcas usando 75% de etanol. Em seguida, segure a estrutura firmemente em uma superfície plana e retire lentamente o molde PDMS da camada curada. Em seguida, coloque uma camada limpa de dois moldes PDMS voltados para baixo em uma laje PDMS plana com mais de 2.5 milímetros de espessura.

Bata suavemente nos recursos do molde de cima usando uma pinça. Observe a interface abaixo dos recursos para escurecimento ou contraste óptico, o que confirma o contato adequado. Agora, preencha o espaço entre o molde PDMS e a placa com adesivo líquido curável por ultravioleta por ação capilar.

Cure parcialmente a estrutura sob luz ultravioleta por 10 segundos, conforme demonstrado anteriormente. Use uma pinça acolchoada macia para descascar suavemente a camada adesiva curável ultravioleta composta e o molde PDMS da placa PDMS. Se necessário, apare o excesso de bordas da camada adesiva curada com uma tesoura afiada.

Em seguida, coloque a camada um presa a uma lamínula de vidro retangular em uma superfície plana. Alinhe a camada dois, ainda presa ao molde PDMS, com a camada um e pressione as duas camadas juntas com firmeza até que as sombras apareçam abaixo dos recursos. Cure a estrutura alinhada sob luz ultravioleta por 10 segundos para unir as camadas um e dois em um chip microfluídico de duas camadas e, em seguida, retire suavemente o molde PDMS do chip colado.

Pipete imediatamente 10 microlitros de solução precursora de gel de poliacrilamida no meio da região do tecido diretamente acima da fenda na camada dois. Pressione suavemente uma lamínula de vidro redonda, com 10 milímetros de diâmetro, na gota para formar um gel plano. Observe o fluxo da solução de gel para a camada um através da fenda e pare na fileira de pilares de barreira.

Cure imediatamente o chip microfluídico montado sob luz ultravioleta por cinco minutos. Em seguida, deixe o chip intacto por aproximadamente uma hora para permitir que o gel de poliacrilamida se solidifique completamente. Em seguida, incube o chip microfluídico em tampão HEPES 0,1 molar a pH 7,4 por pelo menos uma hora para hidratar o gel e reduzir a adesão entre o gel e a lamínula.

Em seguida, use suavemente uma pinça afiada para remover a lamínula da superfície do gel. Coloque um cartucho de policarbonato de grau médico em uma superfície plana com a parte inferior voltada para cima e alinhe um chip seco com a face para baixo com o cartucho. Pipete o adesivo curável por UV nas fendas entre o chip e o cartucho, preenchendo-os por efeito capilar, e cure-o sob luz UV.

Esterilize os dispositivos microfluídicos fabricados, colocando-os sob luz ultravioleta de 200 a 280 nanômetros dentro de um gabinete de biossegurança. Prepare o volume necessário de 50 microgramas por mililitro de colágeno uma solução de trabalho em 1X DPBS no gelo. No gelo, prepare a solução de trabalho Sulfo-SANPAH diluindo dois microlitros de solução-mãe Sulfo-SANPAH, previamente dissolvida em dimetilsulfóxido anidro em 80 microlitros de tampão HEPES 0,1 molar frio a pH 7,4 armazenado a quatro graus Celsius.

Enxugue as bordas do gel de poliacrilamida com lenços de laboratório para secá-lo dentro do dispositivo. Pipete 80 microlitros de solução de trabalho Sulfo-SANPAH na superfície do gel, garantindo a imersão total, e coloque o chip sob luz ultravioleta por cinco minutos para ativar o Sulfo-SANPAH. Enxágue o gel três vezes com tampão HEPES molar frio 0,1 a pH 7,4.

Repita o tratamento com Sulfo-SANPAH pipetando 80 microlitros de solução de trabalho SS sobre o gel e irradiando-o sob luz ultravioleta por cinco minutos. Desta vez, enxágue o gel três vezes com 1X DPBS frio. Por fim, pipete 100 microlitros de solução de colágeno uma sobre o gel de poliacrilamida, garantindo cobertura completa, e deixe agir por uma hora.

Enxágue o colágeno solto com 1X DPBS três vezes e mantenha o gel imerso em 1X DPBS até o uso posterior. Prenda os dispositivos às inserções usando parafusos. Em seguida, prenda até quatro conjuntos de inserção de dispositivo ao suporte projetado para montagem em uma platina de microscópio.

Adicione dois mililitros de meio de cultura a cada poço principal dos dispositivos e através dos canais de remoção de resíduos para lavar e substituir o 1X DPBS. Em seguida, insira os eletrodos de platina no tubo contendo 45 mililitros de meio, garantindo que estejam totalmente submersos no meio. Puxe o meio de cultura através do tubo Tygon com uma seringa e prenda-o bem.

Conecte uma extremidade do tubo com enchimento médio à câmara do eletrodo e a outra extremidade ao dispositivo. Agora, prepare uma suspensão celular seguindo as recomendações de tripsinização ou preparação de suspensão celular e semeie 0,1 milhão de células no poço principal. Monte a configuração no microscópio com as câmaras de eletrodos nas laterais e conecte o medidor de fonte à câmara de eletrodos.

Use três dispositivos com resistência de canal idêntica. Atribua um como um grupo de controle. Aplique a corrente apical à basal ao segundo dispositivo e a corrente basal a apical ao terceiro dispositivo.

Forneça um sinal elétrico sob o modo de pinça de corrente e forneça uma corrente total de 20 microamperes. Escolha a lente objetiva 20X para imagens de tecidos inteiros com um microscópio de epifluorescência. Por fim, escolha o canal 561 para fluorescência vermelha e canais de campo claro.

Selecione um intervalo de tempo de uma hora durante a aquisição de imagens de longa duração. A estimulação elétrica foi aplicada perpendicularmente às células para interromper o potencial transepitelial para estudar seu papel no comportamento do tecido sob diferentes direções de corrente. A imagem de contraste sob fase, apical a basal, ou correntes ATB, fez com que as junções celulares brilhassem dentro de 10 minutos após a aplicação, enquanto as condições de controle e basal a apical, BTA, mostraram baixo contraste e superfícies apicais planas.

As correntes ATB produziram uma convexidade externa na superfície apical da célula. A deformação do gel era fortemente dependente da direção da corrente. As correntes ATB puxaram o gel para cima, enquanto as correntes BTA comprimiram o gel para baixo.

A intensidade da E-caderina juncional aumentou sob correntes BTA, mas diminuiu significativamente sob correntes ATB em comparação com o controle. A intensidade de actina juncional diminuiu sob correntes ATB, mas não aumentou significativamente sob correntes BTA em relação ao controle. As correntes ATB desencadearam extrusões multicelulares de células vivas através da monocamada, enquanto as correntes BTA preservaram a estrutura da monocamada, semelhante ao controle.

A heterogeneidade espacial na distribuição celular foi significativamente maior sob correntes ATB, mas permaneceu baixa e uniforme sob BTA e condições de controle. As taxas de proliferação celular aumentaram sob estimulação ATB, com maiores taxas de divisão ao longo do tempo. Em contraste, as correntes BTA induziram mais eventos de morte celular.