Dissecção de tecidos craniofaciais de peixe-zebra após coloração com azul de Alcian

Estamos explorando os mecanismos pelos quais o palato do peixe-zebra cresce ao longo do tempo usando amostras fixas, bem como imagens de lapso de tempo de embriões com alta resolução espaço-temporal usando microscopia de folha de luz. Nosso protocolo é simples e fácil de seguir. Ele estabelece etapas detalhadas para dissecar e separar as cartilagens craniofaciais de uma larva de peixe-zebra de cinco dias.

Este protocolo permitiu uma caracterização cuidadosa da forma do palato em escalas teciduais e celulares, permitindo-nos avaliar o efeito dos antígenos de comentário na morfogênese do palato. Para começar, obtenha 20 a 25 larvas de peixe-zebra anestesiadas e remova o anestésico assim que as larvas pararem de se mover. Adicione 1,5 mililitros de aldeído paraforme a 4% ao tubo e coloque a amostra em um balancim ajustado para 60 rotações por minuto em temperatura ambiente por duas horas.

Usando uma pipeta, remova o máximo possível do fixador do tubo. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de etanol a 50% à amostra e coloque-a em um balancim em temperatura ambiente ajustada para 60 rotações por minuto por 10 minutos. Agora, usando uma pipeta, aspire o etanol do tubo e adicione 1,5 mililitros de solução de corante azul de alcian à amostra.

Incubar as larvas na solução corante durante 18 a 20 horas à temperatura ambiente, balançando a 60 rotações por minuto. Em seguida, remova a solução da mancha usando uma pipeta e lave as larvas com 1,5 mililitros de água destilada por um a dois minutos em uma cadeira de balanço em temperatura ambiente. Em seguida, adicione um mililitro de solução de alvejante à amostra e incube em temperatura ambiente por 20 minutos sem cobrir os tubos.

Usando uma pipeta, remova a solução de alvejante da amostra e trate a amostra com as soluções de limpeza de tecido um e dois. Depois de remover a solução dois, adicione 1,5 a dois mililitros de solução de armazenamento à amostra. Devido ao teor de glicerol, observe como as amostras coradas afundam gradualmente no fundo em 10 minutos.

Coloque uma larva corada em seu lado lateral na placa de Petri revestida de agarose. Usando uma pinça, raspe suavemente a gema do corpo das larvas. Após a remoção da gema, transfira as larvas para uma placa de Petri fresca para evitar interferência durante a dissecação, segure as larvas perto da parte posterior da cabeça usando um par de pinças.

Com outro par, remova cuidadosamente os olhos sem danificar as estruturas cranianas faciais circundantes. Enquanto segura a larva, ainda com um par de pinças, faça uma incisão no centro do tecido dorsal ao neurocrânio. Em seguida, aperte e retire o cérebro e os tecidos associados.

Em seguida, separe a cabeça das larvas do resto do corpo. A região da cabeça resultante deve incluir o neurocrânio e o crânio visceral ainda anexado nas extremidades anterior e posterior. Corte cuidadosamente os dois pontos de conexão entre o neurocrânio e o crânio visceral com uma pinça para separá-los totalmente.

Finalmente, coloque uma ou duas gotas de glicerol a 100% em uma lâmina de vidro limpa e transfira o neurocrânio dissecado ou o crânio visceral para a lâmina. Usando uma pinça, coloque delicadamente uma lamínula em cima dos lenços de papel, garantindo que nenhuma bolha de ar fique presa, e sele a lamínula com esmalte antes de fazer a imagem. O neurocrânio dissecado exibiu várias estruturas claramente marcadas, incluindo a placa etmoidal, trabécula e cartilagem pericárdica, permitindo uma análise estrutural detalhada.

O crânio visceral incluía a cartilagem de Meckel e elementos adicionais, como o palato quadrado e as cartilagens basilbranquiais. A coloração com azul de Alcian cinco dias após a fertilização permitiu uma visualização clara da placa etmoidal. A largura e o comprimento da placa etmoidal foram consistentemente mensuráveis usando análise de imagem, e o comprimento foi significativamente maior que a largura e dados quantificados de 15 amostras.

A área da placa etmoidal foi extraída dos dados da imagem e confirmada por meio de quantificação com marcações de limite claras. Arranjos celulares distintos foram observados na placa etmoidal com células cuboidais na região medial e células colúmeras nas partes laterais. A coloração Dappy permitiu a visualização de núcleos celulares individuais dentro da placa etmoidal.