Name: Mutagênese baseada em CRISPR-Cas9 no Nematoide Entomopatogênico Steinernema hermaphroditum e a Manutenção de Linhas Mutantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a aplicar CRISPR-Cas9 em Steinernema hermaphroditum para criar mutantes e estudar funções gênicas em simbioses mutualísticas e parasitárias. Este método avança a pesquisa em controle biológico de pragas.

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<ol><li>Stock, S., Blair, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts%3A+The+inside+out+of+a+mutualistic+association%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li>
<li>Murfin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode-bacterium+symbioses--cooperation+and+conflict+revealed+in+the+%26%2334%3Bomics%26%2334%3B+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bull%22%5BJournal%5D)">Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the &#34;omics&#34; age.</a> Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).</li>
<li>Dillman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+nematode+by+any+other+name%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic nematode by any other name.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).</li>
<li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), iyab170(2022).</li>
<li>Sergeant, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+typing%2C+and+insecticidal+activity+of+Xenorhabdus+isolates+from+entomopathogenic+nematodes+in+United+Kingdom+soil+and+characterization+of+the+xpt+toxin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).</li>
<li>Walsh, K. T., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+microbial+populations+in+Steinernema+%28Steinernematidae%2C+Nematoda%29+infected+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae.</a> J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+The+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).</li>
<li>Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nematode+age+and+culture+conditions+on+morphological+and+physiological+parameters+in+the+bacterial+vesicle+of+Steinernema+carpocapsae+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae).</a> J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).</li>
<li>Cao, M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready+or+Not%3A+Microbial+adaptive+responses+in+dynamic+symbiosis+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments.</a> J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).</li>
<li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathogens+as+biological+control+agents%3A+Back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).</li>
<li>Campos-Herrera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecific+virulence+of+entomopathogenic+nematodes+against+the+pests+Frankliniella+occidentalis+%28Thysanoptera%3A+Thripidae%29+and+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+toolbox+for+Photorhabdus+and+Xenorhabdus%3A+pSEVA+based+heterologous+expression+systems+and+CRISPR%2FCpf1+based+genome+editing+for+rapid+natural+product+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling.</a> Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).</li>
<li>Ratnappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+knockdown+by+microinjection+in+the+model+entomopathogenic+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).</li>
<li>Cao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+editing+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+genetically+manipulating+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes.</a> J Vis Exp. (181), e63885(2022).</li>
<li>Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+characterisation+of+Steinernema+hermaphroditum+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%2C+an+entomopathogenic+nematode+from+Indonesia%2C+and+its+phylogenetic+relationships+with+other+members+of+the+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus.</a> Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).</li>
<li>Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Steinernema+hermaphroditum+%28Nematoda%2C+Rhabditida%29%2C+from+West+Uttar+Pradesh%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India.</a> Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).</li>
<li>Schwarz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+and+its+associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+stable+intercellular+bridges+formed+by+incomplete+cytokinesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development.</a> Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+a+human-parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode.</a> PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).</li>
<li>Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+transfection+enhances+RNAi+and+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+non-model+nematode+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems.</a> Sci Rep. 9 (1), 483(2019).</li>
<li>Culp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+nematode+Caenorhabditis+briggsae+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system.</a> Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).</li>
<li>Hellekes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+gene+editing+in+non-model+nematode+Panagrolaimus+sp.+PS1159%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genome+Ed%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159.</a> Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).</li>
<li>Patel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+stable+transgenic+lines+in+the+human-infective+nematode+Strongyloides+stercoralis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis.</a> G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+Designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genome+editing+strategy+to+generate+putative+null+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9.</a> G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+Edits+from+Sanger+Trace+Data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> J Vis Exp. (91), e52096(2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+co-CRISPR+strategy+for+efficient+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).</li>
<li>Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+RNAi+in+Heterorhabditis+bacteriophora%3A+A+nematode+insect+parasite+and+host+for+insect+pathogenic+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts.</a> BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).</li>
<li>Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9%3A+A+new+tool+for+the+study+and+control+of+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites.</a> Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).</li>
<li>Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+parasitic+helminths%3A+A+brief+history+and+prospects+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future.</a> Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).</li>
<li>Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+peroxidase+gene+controlling+body+size+in+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum.</a> Genetics. 226 (2), (2024).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ágar (80-100 de malha)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26411</td><td>Também usado em placas de piruvato LB</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td>Também usado em genotipagem</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072532</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de borosilicato</td><td>Instrumento de Precisão Mundial</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol &nbsp;</td><td>VWR</td><td>433</td><td>5 mg/mL em etanol</td></tr><tr><td>Comamonas aquatica (DA1877)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura para almofada de agarose</td><td>Laboratórios de pesquisa cerebral</td><td>#4860-1D</td><td>48 x 60 mm de espessura No1</td></tr><tr><td>CRISPRScan</td><td></td><td></td><td>https://www.crisprscan.org/</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>DNA Clean e Concentrador-5&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor FemtoJet 4x com cabeça de empunhadura, suporte de agulha tamanho 4 0</td><td>Eppendorf/Calibre</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>Larvas de 5º instar de Galleria melonella</td><td>GrubCo</td><td></td><td>https://www.grubco.com/index.cfm</td></tr><tr><td>Sistema de imagem em gel</td><td>Azure400</td><td>AZI400-01</td><td></td></tr><tr><td>Corante de carga em gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B72</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina (2%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>#41003</td><td></td></tr><tr><td>Primers de genotipagem: DNA oligo, 25 nmol</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Triptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>Também usado em placas de piruvato LB escuro e piruvato LB e nbsp;</td></tr><tr><td>Extrato de Levedura Gibco Bacto</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>Também usado em placas de piruvato LB escuro e piruvato LB e nbsp;</td></tr><tr><td>Conjunto de cabeça de empunhadura: suporte de agulha tamanho 1</td><td>Calibre</td><td>EPE-5196083008</td><td>(emparelhado com agulha de borosilicato 1B120F-4)</td></tr><tr><td>Óleo de halocarbono 700</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Picareta worm de fio duro de platina para manutenção diária</td><td>Pesquisa Tritech</td><td>PT-9901</td><td></td></tr><tr><td>Inferência das edições CRISPR (ICE)</td><td>Synthego</td><td>N/A</td><td>Software usado para analisar sequências de Sanger e identificar indels</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de agulha a laser P-2000</td><td>Sutter</td><td>P-2000G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (MgSO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td>Para o buffer M9, também usado em NGM</td></tr><tr><td>Ponta do microcarregador 2x96ST</td><td>Calibre</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de Montagem de Micromanipulador para Zeiss Axio Observer e Axiovert 200</td><td>Pesquisa Tritech</td><td>NZ-19-2</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Tritech</td><td>SMT1</td><td></td></tr><tr><td>Nicotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Duplex Livre de Nucleases</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq MasterMix</td><td>NEB</td><td>M0486</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de armazenamento de pipetas</td><td>Instrumentos Sutter</td><td>BX10</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio, dibásico (K2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>KOH por NGM</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio, monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Para o buffer M9, também usado em NGM</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de quartzo</td><td>Instrumentos Sutter</td><td>QF100-70-10</td><td></td></tr><tr><td>S. hermaphroditium genoma</td><td>NCBI</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/</td></tr><tr><td>crRNAs SH-UNC-22 Alt-R CRISPR-Cas9</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>VWR</td><td>SS0430</td><td>Também usado em placas de piruvato M9, Dark LB, LB</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio, dibásico (Na2HPO4.7H20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390</td><td>Para o buffer M9</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td>Também usado em placas de piruvato LB & nbsp;</td></tr><tr><td>de fio de platina macia para microinjeção</td><td>Surepure Chemetals</td><td>6824</td><td>Platina 90%, Fio de Liga de Irídio 10%, 0,002 polegada de diâmetro x 5 pés de comprimento</td></tr><tr><td>Suporte de Agulha Padrão</td><td>Pesquisa Tritech</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Steinernema hermaphroditum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>Inveta 3</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-88195-99</td><td>0,08 M</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>pH 8,0</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de Montagem de Micromanipulador Vertical</td><td>Pesquisa Tritech</td><td>NR2</td><td></td></tr><tr><td>Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mutagênese baseada em crispr-cas9 no nematoide entomopatogênico steinernema hermaphroditum e a manutenção de linhas mutantes

CRISPR-Cas9-based Mutagenesis in the Entomopathogenic Nematode Steinernema hermaphroditum and the Maintenance of Mutant Lines

Mutagênese baseada em CRISPR-Cas9 no Nematoide Entomopatogênico Steinernema hermaphroditum e a Manutenção de Linhas Mutantes

Entomopathogenic nematodes (EPNs) in the genus Steinernema and Heterorhabditis maintain mutualistic interactions with Xenorhabdus and Photorhabdus ...

Estamos trabalhando na genética da simbiose das bactérias nematoides, que tem aplicações agrícolas. As ferramentas genéticas na bactéria Xenorhabdus são muito bem desenvolvidas, mas a genética do EPN permanece limitada, dependendo principalmente de triagens de RNAi e EMS. Para começar, obtenha placas de ágar nematoides semeadas com Xenorhabdus griffiniae e Comamonas aquaticus.Colha nematoides Steinernema hermaphroditum nas placas preparadas de NGM contendo Xenorhabdus griffiniae. Incube-as entre 25 e 28 graus Celsius para crescimento ideal. Na noite anterior à microinjeção, colha hermafroditas do estágio J3 em placas de ágar NGM frescas semeadas com Xenorhabdus griffiniae.No dia da microinjeção, escolha hermafroditas jovens adultos para injeção. Extraia a sequência do gene alvo do genoma de referência Steinernema hermafrodito usando BlastP. Selecione um exon codificante precoce, preferencialmente o primeiro éxon, e insira a sequência no CRISPRscan usando as configurações padrão para gerar RNAs CRISPR candidatos.Bombardear os principais RNAs candidatos CRISPR contra o genoma de Steinernema hermafrodito para garantir que não haja correspondências fora do alvo. Armazene os RNAs CRISPR selecionados e os RNAs CRISPR transativadores universais a 100 micromolares cada em um buffer duplex a menos 80 graus Celsius. Derreta 2% de agarose em água usando um micro-ondas.Transfira 50 microlitros da agarose derretida para um copo de cobertura. Cubra imediatamente com um segundo copo de cobertura. Após um tempo de secagem de 20 minutos, remova o vidro superior da tampa e depois etiquete a parte frontal da almofada de agarose.Armazene as almofadas de agarose em temperatura ambiente para uso prolongado por meses a anos. Para preparar as agulhas para a injeção, retire capilares de quartzo em um puxador de filamento a laser e armazene as agulhas em uma caixa de armazenamento de pipeta. Prepare dúplexes de RNA-guia frescos misturando os crRNAs selecionados e RNAs transativadores universais do CRISPR em uma proporção um-para-um.Incube o tubo a 94 graus Celsius por dois minutos, depois esfrie até a temperatura ambiente para recozer os duplexes. Monte a mistura de injeção combinando os dúplexes Cas9, cloreto de potássio e gRNA e incube. Faça três movimentos no tubo de PCR para misturar, depois gire brevemente por 10 a 15 segundos em uma mini centrífuga.Após a mistura final, fie por até um minuto para coletar o conteúdo. Em seguida, use uma ponta de microcargador para colocar um ou dois microlitros de mistura de injeção na agulha. Monte a agulha no suporte, abra a ponta arrastando sobre fita dupla face sob óleo de halocarbono.E teste o tamanho da abertura usando a função limpa do microinjetor. Coloque uma pequena gota de óleo de halocarbono sobre a almofada de 2%agarose. Usando um microscópio dissecador e um fio de platina macio, pegue um jovem hermafrodita adulto.Lave em um buffer M9 para remover as bactérias. Transfira o nematoide para uma almofada de agarose e coloque-o em uma gota de óleo de halocarbono. Use o fio platinado macio para escovar suavemente o nematoide até que fique imobilizado.Monte a almofada no estágio de microinjeção. Localize um braço gonadal e penetre com a agulha. Use a função limpa do injetor para entregar a mistura de injeção a 99 libras por polegada quadrada até que o fluxo gonadal seja visível, confirmando o acesso do reagente ao sincitio.Se acessível, reposicione o estágio e injete o segundo braço gonadal de forma semelhante. Imediatamente após a injeção, ressuspenda o animal injetado em um a dois microlitros de tampão M9 na almofada de agarose. Use um fio fino de platina para retirar o verme injetado da almofada, depois lave o óleo com o tampão M9 e recupere na placa NGM de recuperação semeada com Comamonas aquatica.Incube a placa de recuperação a 25 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, isolem cada nematoide P0 injetado em placas individuais de NGM semeadas com Xenorhabdus griffiniae. Dois RNAs CRISPR foram projetados com o alvo do homólogo Steinernema hermafrodito do unc-22 em locais PAM previamente publicados.A análise de jerk de nematoides expostos à nicotina mostrou diferenças distintas de movimento entre mutantes UNC-22 e nematoides do tipo selvagem. A genotipagem de prole em contração por PCR mostrou múltiplas faixas tênues no local alvo tanto para Pam 3 quanto para Pam 5. O sequenciamento confirmou eventos de inserção e exclusão no local unc-22 alvo.Meu laboratório ampliou meu trabalho de pós-doutorado em genética de EPNs. O CRISPR agora está disponível em três espécies de Steinernema. Neste protocolo, estabelecemos uma técnica eficiente para criar mutantes estáveis e hereditários usando edição gênica CRISPR-Cas9.Com edição genética estável do CRISPR-Cas9, podemos dissecar os mecanismos moleculares por trás da simbiose Steinernema-Xenorhabdus.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

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Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

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Mutagênese baseada em CRISPR-Cas9 no Nematoide Entomopatogênico Steinernema hermaphroditum e a Manutenção de Linhas Mutantes

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