Ensaio de efluxo de fosfolipídios específico para lipoproteína de alta densidade

Desenvolvemos um ensaio substituto para medir a remoção mediada pelo HDL dos lipídios da placa das artérias coronárias, a fim de avaliar o risco de doença arterial coronária. O desafio atual é desenvolver um ensaio simples, rápido e robusto de influxo lipídico HDL para aplicações tanto em pesquisa quanto clínicas. Para começar, adicione todo o conteúdo necessário em um copo sob uma exaustão química e faça um vórtice breve na mistura lipídica para misturar as soluções.

Seque a mistura em um tubo de vidro sob um suave jato de nitrogênio por uma hora para formar um filme lipídico seco no fundo do tubo. Para revestir hidrato de silicato de cálcio, insira um cone de papel de pesagem no tubo de vidro contendo os lipídios secos e adicione 80 miligramas de pó de hidrato de silicato de cálcio no tubo usando o cone para direcionar o pó até a base. Adicione imediatamente 2 mililitros de soro fisiológico normal ao tubo e cubra a parte superior com Parafilm.

Faça vórtice no tubo de vidro manualmente para desalojar a maior parte do lipídio da parte inferior. Coloque o tubo de vidro em um orifício feito em uma plataforma de isopor presa a um vórtice e prenda o tubo à plataforma do vórtice usando fita reforçada. Faça um vórtice no tubo de vidro por 10 minutos e confirme que não há lipídios na parede do tubo.

Transfira o conteúdo do tubo de vidro para um tubo cônico de plástico de 15 mililitros usando uma pipeta de 1 mililitro. Lave o tubo de vidro com 3 mililitros de soro fisiológico e transfira a lavagem para o mesmo tubo de 15 mililitros. Em seguida, coloque o tubo plástico de 15 mililitros contendo hidrato de silicato de cálcio revestido com lipídios em uma centrífuga e centrifuge a 935G por 2 minutos a 4 graus Celsius.

Use uma ponta longa e fina de pipeta para aspirar o sobrenadante. Começando pelo topo do sobrenadante, deslize a ponta da pipeta lentamente ao longo da lateral do tubo enquanto aspira. Incline levemente o tubo durante a aspiração e deixe aproximadamente 200 microlitros de soro fisiológico acima do pellet para evitar perturbá-lo.

Depois, adicione soro fisiológico para levar o volume total para 5 mililitros. Repita a centrifugação e a remoção do sobrenadante quatro vezes. Após a lavagem final, adicione soro fisiológico para levar o volume total a 2,5 mililitros Pipeta 75 microlitros de soro fisiológico em cada poço de uma placa de 0,3 mililitros de 96 poços, de acordo com o número de poços necessários para o conjunto de amostras.

Vortex, o tubo plástico de 15 mililitros contendo LC-CSH, três vezes por 10 segundos cada. Usando uma pipeta de poço único, dispense 50 microlitros de LC-CSH ao longo do lado direito dos poços contendo soro. Após três poços, repita o protocolo de vórtice antes de dispensar nos três poços seguintes.

Gire a placa de 96 poços em 180 graus para que o lado esquerdo dos poços fique agora à direita. Pipete 25 microlitros de amostras de plasma ou soro ao longo do lado direito de cada poço. Para os poços controle positivos, adicione 25 microlitros de plasma ou soro padrão lipídico humano normal de referência.

Em seguida, fele a placa de 96 poços firmemente com filme adesivo e incube a placa selada no escuro por uma hora a 37 graus Celsius e 1.200 rotações por minuto em um termomisturador. Após a incubação, retire a placa do termomisturador e coloque sobre gelo. Centrifuge a placa por dois minutos a 935G a 4 graus Celsius para pelletar as partículas doadoras e interromper a reação de transferência.

Agora, remova cuidadosamente o filme adesivo da placa de 96 poços sem perturbar o pellet LC-CSH. Transfira 50 microlitros de sobrenadante da placa de reação para os poços de uma placa preta de poliestireno de fundo plano de 96 poços usando uma pipeta multipoços. Encha um reservatório com soro fisiológico normal e adicione 50 microlitros de soro a cada poço.

Usando uma pipeta multi-poços. Prepare 1% do Triton X-100 em um frasco plástico Erlenmeyer de 125 mililitros. Encha um reservatório com o Triton X-100 preparado a 1% e adicione 100 microlitros da mesma solução em temperatura ambiente em cada poço.

Misture suavemente com a cabeça de tubo para cima e para baixo duas a três vezes com uma pipeta multipoço e estoure as bolhas usando o ar de uma pipeta de transferência de 3 mililitros. Por fim, meça a fluorescência da lissamina-rodamina usando um fluorômetro com excitação em 540 nanômetros e emissão em 600 nanômetros. Uma curva padrão foi gerada usando LC-CSH marcado com LRHPE diluído serialmente e mostrou uma resposta de fluorescência altamente linear.

No estudo da curva de concentração plasmática, volumes crescentes de plasma humano acumulado foram dispensados em poços triplicados junto com controles salinos. A curva de resposta à dose plasmática mostrou excelente linearidade entre PE, affluxo e volume plasmático, com forte correlação na faixa de 15-35 microlitros. Nosso protocolo simples e rápido, que prevê o risco incidente de doenças cardiovasculares, pode ser usado tanto em pesquisas quanto em estudos clínicos diagnósticos.

Nossos achados demonstram que nosso ensaio pode elucidar o papel tanto dos lipídios celulares quanto extracelulares da placa nas doenças cardiovasculares.