Name: Imagem de cálcio in vivo e ex-vivo de um neurônio do circuito olfatório na larva de Drosophila melanogaster de terceiro ínstar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Aprenda a realizar imagem de cálcio in vivo e ex vivo em neurônios do circuito olfatório de larvas de Drosophila melanogaster. Este protocolo utiliza adesivo tecidual GLUture para imobilização estável, permitindo análises confiáveis de dinâmica do cálcio em neurofisiologia.

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1. Preparando larvas de Drosophila de terceiro ínstar para imagens de cálcio
<ol>
	<li>Manter as moscas em alimentos padrão para moscas (ver Tabela de Materiais) a 25 °C, com 50-60% de umidade relativa (UR) e um ciclo claro/escuro de 12 h.</li>
	<li>Para expressar a Proteína Fluorescente Vermelha (RFP) para identificação de neurônios e GCaMP6f (indicador de cálcio) no(s) neurônio(s) de interesse ('X'), cruze fêmeas virgens da linhagem X-Gal4 com machos portadores de UAS-GCaMP6f e UAS-tdTomato22. NOTA: Para este estudo, a linha Keystone-Gal4 foi usada para conduzir a expressão de tdTomato e GCaMP6f em um único par de neurônios locais inibitórios (Keystone-LNs) no cérebro larval18,19.</li>
	<li>Depois de permitir que moscas machos e fêmeas acasalem e ponham ovos por 48 h, transfira os adultos para um frasco fresco.</li>
	<li>Extraia as larvas de terceiro ínstar (aproximadamente 120 h após a postura dos ovos) flutuando-as em uma solução de sacarose a 15%. Use uma micropipeta P1000 para transferir as larvas flutuantes para um copo de vidro de 1.000 mL.</li>
	<li>Lave as larvas 3-4x, substituindo a água do copo por 800 mL de água fresca destilada de cada vez. Deixe as larvas descansarem por 10 minutos antes de prosseguir com o restante do protocolo.</li>
</ol>
2. Protocolo de fome para larvas de Drosophila de terceiro ínstar (se testar condições de fome vs. não famintas)
<ol>
	<li>Prepare duas câmaras de alimentação colocando um pequeno quadrado de lenço de laboratório em placas de Petri de 6 cm. Para condições sem fome, adicione 350 μL de solução de sacarose 0,2 M; para condições de fome, adicione 350 μL de água destilada.</li>
	<li>Transfira um número igual de larvas lavadas para cada câmara de alimentação. Deixe as larvas se alimentarem de sacarose (sem fome) ou água destilada (sem fome) por 2 h em temperatura ambiente.</li>
</ol>
3. Imagem de cálcio in vivo
NOTA: Todos os experimentos envolvendo o adesivo tecidual devem ser conduzidos usando práticas padrão de segurança de laboratório. É necessário equipamento de proteção individual (EPI), incluindo luvas de nitrilo, jaleco e óculos de segurança ou protetor facial; Luvas de algodão devem ser evitadas devido a reações exotérmicas com cianoacrilato. Evite o contato do adesivo com a pele, olhos ou membranas mucosas. Em caso de colagem da pele, mergulhe a área em água morna com sabão e separe suavemente; Em caso de exposição ocular, enxágue com água morna por ≥5 min e procure atendimento médico imediato. O adesivo deve ser mantido longe de chamas abertas e altas temperaturas, pois o adesivo curado pode liberar vapores irritantes se queimado. Armazene o adesivo a ≤30 °C, longe da umidade e da luz solar direta, em um recipiente hermeticamente fechado quando não estiver em uso.
<ol>
	<li>Prepare o tampão de imagem de cálcio com a seguinte composição: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glicose 10 mM e HEPES 10 mM. Conservar a 4 °C quando não estiver a ser utilizado. NOTA: A solução salina modificada contendo 110 mM de NaCl é uma formulação amplamente aceita para dissecção e imagem larval do SNC e se enquadra na faixa típica usada em estudos de eletrofisiologia e imagem (≈108-128 mM NaCl)23,24,25,26.</li>
	<li>Em uma lamínula de microscópio de 24 x 50 mm (1,5 mm de espessura), crie um poço usando vaselina dispensada de uma seringa.</li>
	<li>Coloque uma pequena gota de adesivo tecidual tópico (60% 2-octil e 40% n-butilcianoacrilato) no centro da lamínula. Espalhe o adesivo uniformemente em uma camada fina e uniforme usando uma haste de vidro.</li>
	<li>Transfira cuidadosamente uma única larva para o adesivo usando um pincel ou arame fino. Pressione suavemente o lado ventral da larva sobre o adesivo. Deixe o adesivo secar, garantindo que a larva esteja totalmente imobilizada.</li>
	<li>Uma vez que a larva esteja imobilizada, coloque a lamínula no microscópio invertido (Figura 1A).</li>
</ol>
4. Imagem de cálcio ex-vivo
<ol>
	<li>Prepare o tampão de dissecção larval com a seguinte composição: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 0,3 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glicose 10 mM e HEPES 10 mM. Conservar a 4 °C quando não estiver a ser utilizado.</li>
	<li>Dissecar as dissecações cerebrais conforme descrito por Ishimoto e Sano10. Resumidamente, usando uma escova ou fio fino, transfira uma única larva para uma placa de Petri de 3,5 cm com elastômero de silicone em camadas na parte inferior.</li>
	<li>Sob um microscópio de dissecação, posicione a larva com o lado ventral voltado para cima e localize o cérebro. Usando uma tesoura de dissecação, faça um corte de cerca de um terço da extremidade anterior da larva. Faça outro corte nos ganchos da boca. Preserve o cérebro enquanto remove os ganchos do corpo e da boca (adaptado de Janelia Flylight Protocol27).</li>
	<li>Identifique o aglomerado de nervos contendo neurônios motores do cordão ventral. Usando uma pinça, afaste suavemente o cérebro do resto da larva dissecada. Apare qualquer excesso de tecido do cérebro. NOTA: Manuseie suavemente a força excessiva pode causar danos aos tecidos, pois o cérebro é frágil.</li>
	<li>Prepare uma lamínula de microscópio com o adesivo tecidual para imagens de cálcio, conforme descrito nas etapas 3.2 a 3.3.</li>
	<li>Usando uma micropipeta P10, aspire cuidadosamente o cérebro dissecado com 5 μL de solução de dissecção da placa de Petri. Expulse lentamente o cérebro para o adesivo. Antes que o adesivo seque, oriente o cérebro em uma posição dorsal para cima (com os dois lobos cerebrais voltados para baixo e o cordão ventral dorsal voltado para cima).</li>
	<li>Usando uma micropipeta P200, transfira 100 μL do tampão de imagem de cálcio sobre o cérebro larval imobilizado na lamínula.</li>
	<li>Coloque a lamínula com o cérebro no microscópio invertido, conectada a um módulo de scanner confocal de disco giratório e uma câmera CCD para imagens de cálcio (Figura 1B). NOTA: Para preparações ex-vivo, certifique-se de orientar o cérebro corretamente enquanto a cola ainda estiver molhada. Para obter a melhor qualidade de imagem, posicione o cérebro de forma que a ROI fique mais próxima da objetiva do microscópio e evite aplicar excesso de cola perto da ROI.</li>
</ol>
5. Protocolo de imagem
<ol>
	<li>Abra o software para imagens de cálcio usando o microscópio confocal. Capture imagens usando uma objetiva de 10x/1,4 NA com filtro alternando entre laser GFP (excitação 488 nm, intensidade 70%, emissão 525 nm/50 m, OD8) e laser RFP (excitação 561 nm, intensidade 50%, emissão 610 nm/75 m, OD8). Defina a exposição entre 100 ms e 1.000 ms, o ganho em 50% do valor de exposição correspondente e um fator de binning de 2 durante a captura de imagem.</li>
	<li>Ajuste o microscópio para uma ampliação de 10x e localize o cérebro sob iluminação de campo claro.</li>
	<li>Identifique o neurônio de interesse procurando o sinal tdTomato com o laser RFP (excitação definida para 561 nm). NOTA: Selecione saturação e reduza gama para definir o valor de exposição correto.</li>
	<li>Assim que a região de interesse (ROI) for identificada, mude para o laser GFP (excitação definida para 488 nm) para capturar sinais GCaMP6f. Certifique-se de que os sinais tdTomato e GCaMP colocalizem antes de capturar imagens de pilha de ambos os canais. NOTA: Ajuste as configurações de imagem para gravações de pilha tdTomato e GCaMP6f para maximizar a fluorescência.</li>
	<li>Capture duas gravações de séries temporais separadas de sinais tdTomato e GCaMP6f simultaneamente a uma taxa de 0,5 quadros/s (para um total de 2 min). NOTA: O cérebro larval dissecado permanece viável por aproximadamente 10 min sob essas condições de buffer; Após esse período, os sinais se degradarão.</li>
	<li>Quando a amostra estiver pronta para a imagem, capture duas gravações de séries temporais separadas de sinais tdTomato e GCaMP6f simultaneamente a uma taxa de 0,5 quadros/s (para um total de 2 min). NOTA: O cérebro larval dissecado permanece viável por aproximadamente 10 min sob essas condições de buffer; Após esse período, os sinais se degradarão. NOTA: Ao realizar análises quantitativas, recomendamos aumentar a potência do laser e ajustar o ganho de exposição do detector conforme necessário, mantendo a escala de intensidade linear.</li>
</ol>
6. Tratamento e análise dos dados
<ol>
	<li>Abra e importe as pilhas de sinais tdTomato e GCaMP6f para o ImageJ (NIH)28.</li>
	<li>Para identificar a região de interesse (ROI) correta, mescle os sinais tdTomato e GCaMP6f para confirmar a colocalização. Após a verificação, divida os canais tdTomato e GCaMP6f.</li>
	<li>No menu superior, selecione Plug-ins | Novo e clique em Macros para iniciar uma nova macro. Em seguida, importe as macros personalizadas baseadas em ROI para o ImageJ. Selecione a pilha GCaMP6f e clique em Executar para análise de cálcio.</li>
	<li>Processe os sinais de fluorescência usando uma macro ImageJ personalizada (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). A macro primeiro gera projeções de intensidade máxima, executa a correção de movimento usando o plug-in StackReg (modo de registro rígido )29 e aplica a correção de branqueamento.</li>
	<li>Um pop-up "Ação necessária" aparecerá solicitando a seleção manual do ROI, que permite aos usuários desenhar manualmente um ROI amplo. Clique em OK para continuar a análise. Para realizar a correção de movimento, certifique-se de que a caixa retangular cubra toda a ROI em todos os quadros para uma correção de movimento precisa, mantendo a forma espacial e de ROI local entre os quadros. NOTA: As gravações foram registradas no ImageJ usando o StackReg. Quando o movimento no plano era grande (deslocamento XY cumulativo &gt; 1 μM) ou o desvio Z axial levava à perda de foco, o registro se tornava não confiável ou a amostra era totalmente perdida da janela de imagem. Assim, as amostras que mostraram deriva extrema ou sinais de cálcio em declínio (&gt;30%) foram automaticamente marcadas e excluídas da análise a jusante para garantir medições precisas da atividade neuronal. Esses limiares são consistentes com as práticas de controle de qualidade comumente aplicadas em estudos de imagem de cálcio 30,31,32,33. A exclusão também garantiu que apenas registros estáveis com transientes de cálcio ligados a estímulos confiáveis fossem usados para análises.</li>
	<li>Para a análise, extrair traços de fluorescência de ROIs circulares definidas manualmente, guiadas por autocorrelação de pixels; esses ROIs abrangerão todo o campo de neurônios trapezoidais.<ol>
		<li>Extraia os dados brutos de intensidade de fluorescência para dois fluoróforos: GCaMP6f/GFP e tdTomato/RFP, usando macros personalizadas no ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, consulte a Tabela de materiais).</li>
		<li>Aplique uma janela deslizante com um ROI de 20 x 20 pixels e um tamanho de etapa de 10 pixels no campo de visão. Para cada ROI, a macro calculará: (1) a intensidade em todos os quadros, (2) a diferença de flutuação da linha de base (ou seja, a diferença entre os valores de intensidade máxima e mínima durante os primeiros 10 quadros) e (3) a mudança máxima de intensidade quadro a quadro (ΔF). As ROIs que mostram flutuações de intensidade inferiores a 10 unidades serão eliminadas e apenas os valores de ΔF mais nítidos serão selecionados para análise posterior.</li>
		<li>Normalize os traços de fluorescência usando os seguintes métodos:<ol>
			<li>Normalização Fmax e Fmin: Calcule o Δ normalizado usando a fórmula: 
			<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68956/68956eq1.jpg" style="margin: auto;"> Onde F é a fluorescência bruta em cada ponto de tempo, Fmin é a fluorescência mínima (linha de base) e Fmax é a fluorescência máxima durante a gravação.</li>
			<li>Normalização ΔF/F 0: Além disso, executea normalização ΔF/F o, onde Fo (linha de base) é determinado pelos primeiros 10 quadros de cada gravação, usando a fórmula: 
			<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68956/68956eq2.jpg" style="margin: auto;"> Onde Ft é a fluorescência no tempo t e F0 é o valor da linha de base calculado a partir dos primeiros 10 quadros.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Depois de extrair os sinais GCaMP6f, clique com o botão esquerdo e selecione tudo, recorte e cole para transferir todos os valores para uma nova planilha do Excel. Na barra de menu superior, selecione Dados | Texto para colunas. Um pop-up do assistente "Texto para coluna" aparecerá. Na etapa 1, selecione Delimitado e clique em Avançar. Na etapa 2, em Delimitadores, selecione Tabulação e vírgula e clique em Avançar. Na etapa 3, selecione Concluir. OPCIONAL: Para plotar os sinais de cálcio normalizados, realce Fnorm_FminFmax e selecione Gráfico de dispersão.</li>
	<li>Procure um arquivo .csv gerado contendo: (1) valores brutos de fluorescência F, (2) ΔF/Fo e (3) Fnorm (intensidade de fluorescência normalizada). Organize o conjunto de dados final em quatro colunas: (1) tempo (quadros), (2) condição da amostra (faminto ou alimentado), (3) ID de replicação (amostra individual) e (4) intensidade normalizada (valores Fnorm dimensionados de 0 a 1).</li>
	<li>Por fim, execute a análise e a visualização de dados em R usando scripts R personalizados (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, consulte Tabela de materiais).<ol>
		<li>Importe o script R personalizado para um novo projeto R. Verifique se os pacotes R necessários, incluindo ggplot2, dplyr e readr, estão instalados e atualizados antes de executar a análise.</li>
		<li>A partir da linha 1 do script R personalizado, pressione Executar continuamente para realizar a análise de cálcio. Certifique-se também de que a saída inclua mapas de calor que ilustram a intensidade de cálcio normalizada para os primeiros 30 quadros, 60 quadros e todos os quadros da gravação de série temporal e boxplots para mostrar a mediana das intensidades normalizadas.</li>
		<li>Avalie a significância da intensidade de cálcio normalizada usando o teste U de Mann-Whitney.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Eliminação e descontaminação de resíduos
<ol>
	<li>Após os experimentos, remova os detritos grosseiros das ferramentas e superfícies em água corrente e desinfete com etanol a 70% ou alvejante a 10% seguido de água estéril. Trabalhe em uma superfície desinfetada e lave as mãos após a remoção da luva; Não coma ou beba no laboratório.</li>
	<li>Coloque o tecido larval e os descartáveis contaminados em sacos de risco biológico e autoclave antes do descarte.</li>
	<li>Descarte os resíduos adesivos totalmente curados no lixo geral; O adesivo não curado e os descartáveis contaminados devem ser coletados em um recipiente de resíduos químicos perigosos lacrado e rotulado.</li>
	<li>Coloque todos os objetos cortantes (lâminas, agulhas, vidros quebrados) em um recipiente resistente a perfurações.</li>
	<li>Recolha solventes inflamáveis (etanol, acetona) em recipientes de resíduos inflamáveis rotulados.</li>
</ol>

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<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).</li>
<li>Larval Dissection. , Howard Hughes Medical Institute. 
 <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o">https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o</a> (2019).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+an+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: an open platform for biomedical image analysis.</a> Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>De Vries, S. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+standardized+physiological+survey+reveals+functional+organization+of+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex.</a> Nat Neurosci. 23 (1), 138-151 (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+sensory+transmission+and+neuronal+plasticity+in+primary+sensory+neurons+with+a+positively+tuned+voltage+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with a positively tuned voltage indicator.</a> Nat Commun. 16 (1), 6396(2025).</li>
<li>Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+facilitation+by+neuropeptide+signaling+mediates+odor-driven+food+search%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search.</a> Cell. 145 (1), 133-144 (2011).</li>
<li>Slankster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+underlying+starvation-dependent+modulation+of+olfactory+behavior+in+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva.</a> Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).</li>
<li>Lehnert, B. P., Baker, A. E., Gaudry, Q., Chiang, A. S., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+TRP+channels+in+auditory+transduction+and+amplification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of TRP channels in auditory transduction and amplification in Drosophila.</a> Neuron. 77 (1), 115-128 (2013).</li>
<li>Murthy, M., Turner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+in+vivo+patch-clamp+recordings+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn%3A+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li>
<li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li>
<li>Simpson, J. H., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+and+optogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional imaging and optogenetics in Drosophila.</a> Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Estoques e Ações de Mosca Manutenção</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ração para moscas nutrifly</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-112</td><td></td></tr><tr><td>UAS-GCaMP6f, tdTomato</td><td>Presente do Dr. JH Kim&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)</td><td>BDSC</td><td>49232</td><td></td></tr><tr><td>Protocolo de Reagentes para Fome</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 6 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106G</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes para tampão de Imagem e Dissecação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>J.T. Baker, Ciências Avantor.</td><td>JT1311-1</td><td>CAS: 1311-01, 500g</td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16828.36</td><td>CAS: 50-99-7, 500g</td></tr><tr><td>HEPES-2-[4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinil]-ácido etanossulfônico</td><td>J.T. Baker, Ciências Avantor.</td><td>JT4018-1</td><td>CAS: 4018-01, 100g</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>VWR</td><td>97064-150</td><td>CAS: 7786-30-3, 100g</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J64189.36</td><td>CAS: 7447-40-7, 500g</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>EMD Milipore Sigma</td><td>EMD-SX0420-1</td><td>CAS: 7647-14-5, 500g</td></tr><tr><td>Ferramentas e Reagentes para Dissecação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amortecedor de Dissecação</td><td></td><td></td><td>Composição fornecida no texto</td></tr><tr><td>Placas de Petri Olympus, 60 x 15mm ventiladas</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-105</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer Base</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>24236-10A</td><td></td></tr><tr><td>Agente de Cura Base de Elastomer Sylgard 184</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>24236-10B</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Estilo 5, EMS</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>78320-5</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas - Corte de 3mm</td><td>Ferramentas Científicas Finas</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Equipamentos/Reagentes de Imagem e Montagem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Módulo de Scanner Confocal</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-W1</td><td>Conectado ao microscópio</td></tr><tr><td>Buffer de Imagem</td><td></td><td></td><td>Composição fornecida no texto</td></tr><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8&nbsp;</td><td>Conectada a um módulo de scanner confocal de disco giratório e a uma câmera CCD</td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura de Microscópio, 24mm x 50mm, # 1,5 Espessura</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo Tópico MWI Veterinary GLUTURE</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0632797</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina Pura</td><td>Walgreens</td><td>912556</td><td></td></tr><tr><td>Links para Recursos Públicos Disponíveis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioRender</td><td></td><td></td><td>https://www.biorender.com/</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>912556</td><td>https://imagej.net/ij/</td></tr><tr><td>Vídeo do protocolo Janelia Flylight</td><td>https://www.janelia.org/</td><td></td><td>https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o</td></tr><tr><td>Mathew Lab Github</td><td></td><td></td><td>https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging</td></tr></tbody></table>

imagem de cálcio in vivo e ex-vivo de um neurônio do circuito olfatório na larva de drosophila melanogaster de terceiro ínstar

In-vivo and Ex-vivo Calcium Imaging of an Olfactory Circuit Neuron in the Third-Instar Drosophila melanogaster Larva

Para demonstrar nossa abordagem de imagem de cálcio larval, nós a aplicamos com sucesso a preparações in vivo e ex-vivo das larvas de Drosophila (Figura 2 e Figura 3, Vídeo 1, Vídeo 2, Vídeo 3 e Vídeo 4). Medimos a dinâmica do cálcio em larvas de Drosophila de terceiro ínstar expressando GCaMP6f e Td-Tomato em um único par de Keystone-LNs no cérebro larval18,...

Imagem de cálcio in vivo e ex-vivo de um neurônio do circuito olfatório na larva de Drosophila melanogaster de terceiro ínstar

Calcium imaging is crucial for studying neural dynamics and brain function. However, current methods for imaging calcium in Drosophila larvae are ...

in-vivo-ex-vivo-calcium-imaging-an-olfactory-circuit-neuron-third

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve um método confiável para anestesiados e de imagem de...

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Nós descrevemos uma técnica estabelecida para medir e analisar odor evocadas respostas de cálcio no lobo antenal de...

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

Este vídeo descreve imagens de cálcio in vivo em neurônios de Drosophila usando GCaMP. O clipe de protocolo em destaque mostra como registrar alterações na fluorescência do GCaMP dos neurônios do corpo do cogumelo durante um experimento de condicionamento olfativo.

Drosophila In Vivo Imagem de cálcio: um método para imagem funcional da atividade neuronal

Este vídeo demonstra um método para imagens de cálcio in vivo usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em moscas. Ele descreve as etapas para preparar as moscas para microscopia, conduzir o condicionamento olfativo e visualizar o influxo de cálcio induzido por odor.

in vivo Imagens de cálcio usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em Drosophila melanogaster

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Este vídeo demonstra imagens de cálcio para estudo Drosophila respostas cerebrais a neuropeptídeos. Os neurônios que expressam um indicador fluorescente de cálcio revelam a dinâmica do cálcio intracelular e as respostas funcionais às moléculas de sinalização.

Imagens de cálcio ex vivo para estudar as respostas cerebrais de Drosophila a neuropeptídeos

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Este artigo descreve um protocolo para a ex vivo cálcio imagem latente do cérebro drosófila . Neste método, compostos naturais ou sintéticos podem ser aplicados para o buffer para testar sua capacidade de ativar neurônios particulares do cérebro.

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Aqui, discutimos um fluxo de trabalho para preparar, dissecar, montar e obter imagens de cérebros de explantes vivos de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster para observar a dinâmica celular e subcelular sob condições fisiológicas.

Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos com Drosophila através de imagens ex vivo de cálcio, permitindo a exploração dos potenciais mecanismos de epilepsia em nível celular.

Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Uma abordagem de imagem de cálcio permite o registro de respostas induzidas pelo paladar no cérebro de moscas acordadas enquanto uma solução é aplicada ao labelo. As respostas gustativas primárias em Drosophila melanogaster são usadas como exemplo, mas este protocolo pode ser adaptado para estudar neurônios a jusante ou outras espécies.

In vivo Imagem de cálcio de respostas neurais induzidas pelo paladar em Drosophila adulta

Aprenda a realizar imagem de cálcio in vivo e ex vivo em neurônios do circuito olfatório de larvas de Drosophila melanogaster. Este protocolo utiliza adesivo tecidual GLUture para imobilização estável, permitindo análises confiáveis de dinâmica do cálcio em neurofisiologia.

Imagem de cálcio in vivo e ex-vivo de um neurônio do circuito olfatório na larva de Drosophila melanogaster de terceiro ínstar

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