Avaliação da segurança microbiana de laticínios usando perfil proteômico bacteriano via abordagem MALDI

Desenvolvemos um protocolo para preparar e isolar comunidades microbianas de vários produtos diários, como leite, creme, manteiga e queijo. Uma vez isolado, esse microrganismo pode ser identificado rápida e com precisão usando a MALDI-TOF MS. Otimizar as condições da cultura continua sendo um desafio fundamental, junto com lacunas no banco de dados e a exigente extração de bactérias gram-positivas e formadoras de esporos. Para começar, obtenha uma amostra representativa do produto lácteo e misture cuidadosamente para garantir a uniformidade.

Assépticamente, transfira um mililitro ou um grama de amostras sólidas para um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros contendo nove mililitros de meio líquido estéril. Faça vórtice vigorosamente no tubo por 30 a 60 segundos para homogeneizar a amostra. Em seguida, prepare uma série de diluições dez vezes mais variadas transferindo um mililitro da suspensão homogeneizada para tubos sucessivos, cada um contendo nove mililitros de solução estéril.

Misture cada diluição cuidadosamente por meio de vórtice ou agitação. Depois, pegue 0,1 mililitro da amostra original, ou de uma das diluções preparadas, e transfira-a para a superfície de uma placa de Petri preparada contendo o meio de ágar apropriado. Usando um espalhador estéril, distribua uniformemente o inóculo pela superfície da placa de ágar.

Para incubação aeróbica, inocule placas de ágar APT, M17, CBL, MPCA e TSA com as amostras preparadas. Incube as placas em condições aeróbicas a 37 e 30 graus Celsius por 24 horas. Para incubação anaeróbia, coloque as placas de ágar de MRS inoculadas em uma câmara anaeróbica e incube a 37 e 30 graus Celsius por 24 a 72 horas.

Remova as placas da incubadora e examine-as diariamente para monitorar o crescimento microbiano. Usando um laço microbiano de um microlitro, estrie as colônias selecionadas no mesmo meio de ágar para subcultivá-las. Incubar sob as mesmas condições usadas anteriormente.

Para análise por espectrometria de massas, comece preparando a solução da matriz MALDI. Prepare a mistura de solvente usando 50% de acetonitrila, 47,5% de água com grau HPLC e ácido tricloroacético 2,5%. Dissolva o composto da matriz na mistura de solvente até uma concentração final de aproximadamente 10 miligramas por mililitro.

Para a identificação de bactérias em EM usando o método de transferência direta de colônia, utilize um laço estéril para transferir um microlitro de uma colônia bacteriana cultivada para um ponto na placa-alvo do MALDI. Espalhe o material bacteriano para criar uma camada fina e uniforme na placa. Depois de seco, adicione um microlitro de solução matriz HCCA por cima e deixe secar ao ar em temperatura ambiente.

Para o método de extração de ácido fórmico no alvo, use um alvo microbiano descartável ou um palito de dente estéril para coletar uma pequena quantidade de biomassa bacteriana de uma única colônia. Espalhe o material diretamente em um ponto da placa alvo do MALDI para criar uma camada fina e uniforme. Adicione um microlitro de solução de ácido fórmico a 70% sobre a área espalhada.

Depois que a mancha estiver seca, sobreponha-a com um microlitro de solução matriz HCCA e deixe secar ao ar em temperatura ambiente. Para o método de extração de proteínas em tubo, transfira de uma a três colônias completas de uma placa de cultura de ágar para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 300 microlitros de água estéril. Adicione 900 microlitros de etanol absoluto para alcançar uma concentração final de aproximadamente 75%. Após misturar brevemente o conteúdo, centrifuge o tubo por dois minutos a 15.000 g em temperatura ambiente.

Depois, descarte cuidadosamente o sobrenadante sem mexer na pastilha celular. Depois, adicione de 20 a 50 microlitros de ácido fórmico a 70% ao pellet de células secas. Misture o conteúdo pipetando ou fazendo vórtices até que o pellet esteja totalmente resuspenso.

Agora, adicione um volume igual de acetonitrila à suspensão de ácido fórmico e misture bem. Centrifuge o tubo a 15.000 g por dois minutos. Transfira um microlitro do sobrenadante resultante para um ponto designado em uma placa alvo MALDI e deixe secar.

Depois, sobreponha a mancha seca com um microlitro de solução matriz HCCA. Pipete um microlitro de um padrão de teste bacteriano contendo um extrato de Escherichia coli DH5 alfa ou do calibrador microbiológico contendo extrato de proteína ATCC 25922 de E. coli, ribonuclease e mioglobina. Para aquisição de espectros e identificação microbiana, prepare pontos de calibração na placa-alvo MALDI.

Carregue a placa alvo MALDI com os pontos de amostra preparados e os pontos de calibrante no instrumento de espectrometria de massa. Execute a análise de calibração no modo de calibração para calibrar o sistema. Operar o espectrômetro de massa em modo linear positivo de íons para aquisição geral de espectros.

Em seguida, ajuste o alcance de detecção de massa do espectrômetro de massa para cobrir a relação massa-carga de 2.000 a 20.000. Adquira espectros em duplicado para cada ponto para gerar pelo menos quatro réplicas técnicas por amostra. Agora, aplique o método Savitzky-Golay como um algoritmo de suavização.

Use o algoritmo TopHat para correção de linha de base e remover ruído de fundo. Depois, detecte picos usando o modo centroide. Faça upload dos espectros de massa processados de isolados bacterianos desconhecidos para a plataforma de identificação microbiana dentro do software MALDI e execute a identificação.

Avalie as pontuações de identificação de acordo com os padrões de limiar do fabricante. Os espectros de espectrometria de massa apresentavam perfis proteicos específicos de cada espécie, permitindo a identificação em nível de gênero ou espécie. O dendrograma revelou alta semelhança observada entre linhagens da mesma espécie e diferenciação clara entre elas.

Um tempo de incubação mais curto, de 12 horas, para Bacillus licheniformis produziu um valor de pontuação de DI mais alto, de 2,38, enquanto uma incubação mais longa, de 18 a 24 horas, levou a um valor de pontuação de DI mais baixo, de 1,85, devido à predominância dos sinais de esporos. Entre os métodos de preparação da amostra, a extração proteica em tubo deu o maior valor de pontuação de DI de 2,23, seguida pela extração de ácido fórmico no alvo com 1,97, e transferência direta de colônias, que resultou na menor pontuação de 1,61. Ao combinar culturomáticas com preparação personalizada da amostra, o MALDI possibilita uma análise do microbioma mais precisa e rápida a menor custo, produzindo resultados comparáveis aos métodos de referência do 16S rRNA.

Esse protocolo permite o monitoramento rotineiro e de alta capacidade de microrganismos em produtos lácteos, melhorando a velocidade e a precisão da detecção e, em última análise, fortalecendo os sistemas de qualidade e segurança dos alimentos. Expandir os bancos de dados MALDI e automatizar fluxos de trabalho em laboratórios industriais irá melhorar a identificação microbiana, aumentar o fluxo, reduzir erros e acelerar o monitoramento da microbiota.