Preparação de amostras para estudos metabolômicos de espectrometria de massa de célula única: lavagem, têmpera, secagem e armazenamento de células combinadas

Desenvolvemos protocolos para preservar a integridade dos metabólitos celulares para estudos de espectrometria de massa de célula única. Investigamos como as condições de lavagem, têmpera e armazenamento afetam os metabólitos celulares. Novos métodos de preparação de amostras e técnicas de espectrometria de massa foram desenvolvidos recentemente para avançar os estudos metabolômicos de célula única para entender melhor a heterogeneidade celular e os mecanismos da doença.

Os pesquisadores precisam superar vários desafios importantes, incluindo quantidade limitada de amostras, sensibilidade de detecção reduzida devido à complexidade da amostra e metabólitos alterados devido à preparação e análise da amostra. Demonstramos técnicas abrangentes de preparação de amostras que podem preservar metabólitos celulares e integridade celular para estudos metabolômicos de espectrometria de massa de célula única. Nossos protocolos podem oferecer uma maneira simples e eficaz de preparação, armazenamento e transporte de amostras para estudos metabolômicos de células únicas usando diferentes técnicas de espectrometria de massa.

Para começar, incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada contendo 5% de dióxido de carbono. Monitore a confluência das células diariamente e passe-as quando as culturas atingirem 80% de confluência. Para passar, aspire o meio do prato e enxágue uma vez com cinco mililitros de PBS.

Incube as células com dois mililitros de 0,25% de tripsina EDTA a 37 graus Celsius por três minutos para facilitar o descolamento celular. Neutralize a tripsina adicionando oito mililitros de meio completo pré-aquecido e pipete suavemente para dispersar as células. Transfira um mililitro da suspensão para nove mililitros de meio fresco e completo para contar as células.

Para semear as células, dilua-as até uma concentração final de uma vez 10 elevado a seis células por mililitro. Coloque lamínulas de vidro individuais de 18 milímetros nos poços de uma placa de 12 poços. Adicione dois mililitros de meio completo e 200 microlitros da suspensão celular em cada poço para atingir duas vezes 10 elevado à potência de cinco células por poço.

Incube as células durante a noite para permitir a fixação. Para lavar as células, adicione dois mililitros de solução fria de formiato de amônio a cada poço da placa de 12 poços. Em seguida, usando uma pinça estéril, levante suavemente cada lamínula contendo células de aderência de seu poço e coloque-a brevemente por dois a três segundos em um poço separado pré-preenchido com dois mililitros de solução fria de formiato de amônio a 0,9%.

Coloque cada lamínula de cobertura enxaguada com formato de amônio com as células voltadas para cima em uma placa de Petri dentro de um recipiente de papel alumínio. Despeje lentamente 10 a 20 mililitros de nitrogênio líquido sobre as lamínulas para garantir a cobertura completa. E incline imediatamente a placa de Petri com uma pinça para decantar qualquer nitrogênio líquido restante.

Usando luvas criogênicas e pinças isoladas, coloque a placa de Petri contendo as lamelas de resfriamento de nitrogênio líquido na câmara do concentrador de vácuo. Processe as amostras usando as configurações de vácuo padrão por cinco a sete minutos até que o nitrogênio líquido visível evapore e as lamínulas pareçam secas. Certifique-se de que as lamínulas secas não contêm nitrogênio líquido residual ou cristais de gelo.

Em seguida, embrulhe o recipiente com uma toalha de papel e transfira-o para um freezer a 80 graus Celsius por 48 horas. Após o armazenamento, transfira as lamínulas contendo a placa de Petri para um desidratado em temperatura ambiente por 10 minutos. Certifique-se de que o gelo condensado ou a água nas lamínulas desapareçam completamente antes de removê-los do dessecador.

Divida as amostras em dois grupos e trate-as adequadamente. Agora, monte a sonda única no estágio XYZ e fixe-a em um manipulador XYZ motorizado posicionado abaixo de um microscópio digital. Acople a configuração de sonda única a um espectrômetro de massa para análise SCMS.

Use acetona nitrílica contendo 0,1% de ácido fórmico com uma pureza de pelo menos 99,9% como solvente de extração e entregue-o a uma taxa de fluxo de 150 nanolitros por minuto usando uma bomba de seringa. Defina os parâmetros de espectrometria de massa para os modos de íons positivos e negativos. Agora, coloque as duas lamínulas do grupo um e do grupo dois juntas no estágio XYZ motorizado da configuração SCMS de sonda única e use o microscópio para selecionar aleatoriamente as células para análise.

Depois de adquirir espectros de massa, analise aproximadamente 30 células por grupo usando a mesma sonda única, taxa de fluxo de solvente e tensão de ionização. Pré-processou os dados brutos do SCMS usando um script R personalizado e aplicou a remoção de fundo e ruído seguida pela normalização da intensidade de íons para a corrente total de íons. Desisótopo os dados SCMS usando o isótopo MSD do pacote Python.

Execute o alinhamento de pico usando um script Python interno. Aplique uma largura de compartimento de 0,01 taxa de carga mestre para compartimentalização e uma tolerância de massa de 0,01 taxa de carga mestre ou cinco partes por milhão para alinhamento de pico. Realize análises estatísticas de dados usando o Metabo Analyst 6.0.

Realize um teste T e gere um mapa de calor mostrando os níveis relativos de metabólitos. Selecione a opção usada top 100 e teste T ou Inova para gerar os 100 principais metabólitos classificados por significância e trace um mapa de calor usando esses 100 principais metabólitos com diferenças significativas. Por fim, pesquise os valores precisos de carga mestre no banco de dados de metaboloma humano usando uma tolerância de massa de 10 partes por milhão para pesquisa no banco de dados.

A análise do componente principal no modo de íon positivo mostrou que o grupo um e o grupo dois se sobrepuseram estreitamente, indicando perfis de metabólitos altamente semelhantes. No modo de íons negativos, um padrão comparável foi observado, embora o grupo dois parecesse um pouco mais distinto. A análise do mapa de calor dos 100 principais metabólitos exibiu padrões de abundância altamente consistentes entre o grupo um e o grupo dois em ambos os modos iônicos.

Não são observadas grandes mudanças ou agrupamentos específicos de grupos. Embora pequenas variações em alguns grupos de metabólitos possam refletir diferenças na eficiência de ionização ou estabilidade do metabólito.