Indução de precisão e distinção dos reflexos de tosse e espirro em camundongos

Esse protocolo foca no reflexo respiratório em camundongos. Nosso objetivo é estimular a traqueia e a cavidade nasal para induzir tosse e espirros, e isso vai diferenciar esses dois tipos de eventos com base nos recursos sonoros. Estudos anteriores frequentemente usavam capsaicina nebulizada ou ácido cítrico para estimular o exame respiratório e os comportamentos de tosse e espirros em camundongos.

No entanto, ainda não está claro se a estimulação de verificação respiratória por nebulização induz tosse, espirros ou ambos, já que atualmente não existe um método confiável para distinguir essas duas respostas. Para este projeto, estabelecemos um método para induzir tosse e espirros, estimulando seletivamente a traqueia ou a cavidade nasal. Também utilizamos análise acústica para identificar as características distintivas entre tosse e espirro.

Nossa pesquisa em massa oferece uma ferramenta poderosa que apoiará diretamente o desenvolvimento de futuros medicamentos para distúrbios de tosse e espirros. Para começar, corte uma agulha calibre 28 em uma cânula de aproximadamente cinco milímetros de comprimento. Usando pinças e papel abrasivo, alise ambas as extremidades e fixe uma das extremidades em um tubo de silicone.

Conecte a cânula conectada a tubo a uma seringa de um mililitro e lave a cânula com água para verificar a permeabilidade. Em seguida, dobre a cânula em um ângulo de 90 graus com uma proporção de dois para três braços. Insira o braço mais longo no tubo de silicone de cinco centímetros de comprimento.

Distribua aleatoriamente os camundongos em três grupos, com seis camundongos cada. Agora, prenda o rato anestesiado em posição supina na mesa. Após raspar os pelos cranianos e cervicais, desinfete a área com iodóforo e álcool.

Ao microscópio, incisa a pele cervical por aproximadamente um centímetro e disseca de forma direta tecidos e músculos para expor a traqueia. Perfure o tecido mole entre as cartilagens cricoide e traqueal usando uma agulha calibre 32. Depois, crie uma abertura traqueal mínima com tesoura oftálmica.

Insira a cânula metálica revestida de silicone aproximadamente um milímetro no lúmen traqueal e fixe a junção cânula-traqueia com um ponto 7-0. Agora, incisa o couro cabeludo por aproximadamente um centímetro e faça um túnel subcutâneo sem rodeios do pescoço até o crânio. Passe o tubo de silicone pelo túnel subcutâneo até o crânio, fixe-o no crânio usando cimento dental e depois suture a pele.

Suture a incisão cervical e deixe o animal se recuperar por cinco dias. Coloque a sonda ultrassônica com um anel de vedação compatível com a porta e insira a sonda na porta da câmara de pletismografia de todo o corpo para garantir contato hermético. Conecte a câmara de pletismografia de corpo inteiro ao sensor de fluxo e ao sistema de fluxo de polarização.

Conecte um tubo de silicone fixo no crânio a um tubo de extensão de 30 centímetros e coloque o mouse na câmara de pletismografia de corpo inteiro. Estenda o tubo pela porta superior da câmara e vede a porta usando argila de modelar ao redor do tubo. Verifique a estanqueidade ao ar confirmando que os picos da forma de onda respiratória estão dentro de quatro, mais ou menos dois.

Conecte uma seringa de um mililitro carregada com cinco mililitros de solução de capsaicina ao tubo de extensão e a monte na bomba de microinjeção. Posicione uma câmera de alta velocidade voltada para a câmara. Ajuste a distância e o foco da câmera para uma visão clara, e ajuste a taxa de amostragem para 160 quadros por segundo.

Agora, simultaneamente, inicie a pletismografia de corpo inteiro, o ultrassom e o software da câmera. Acione a bomba para iniciar a infusão de capsaicina e registre a contagem de tosse por 10 minutos. Prepare os animais e todos os materiais necessários para o procedimento.

Após anestesiar e preparar o mouse, prenda-o em uma estrutura estereotáxica. Desinfete a área cirúrgica com iodóforo e álcool. Incisa a pele sobre o crânio e o osso nasal, usando um bisturi para expor o osso nasal.

Usando uma microfuradeira, crie um furo de 0,5 milímetro na junção entre o osso nasal e o processo lateral da cartilagem septal nasal. Agora, exponha a mucosa nasal pelo orifício da rebarba. Levante suavemente a mucosa nasal usando uma agulha calibre 32 para expor a cavidade nasal.

Depois, monte o tubo de polietileno no braço estereotáxico. Alinhe a ponta do tubo com a abertura do furo da rebarba, fixe o tubo no osso nasal usando cimento dentário e depois costure a pele. Coloque o rato em uma almofada térmica e deixe ele se recuperar até a consciência retornar.

Conecte a câmara de pletismografia de corpo inteiro ao sensor de fluxo e ao sistema de fluxo de polarização conforme o manual do fabricante. Em seguida, instale a sonda ultrassônica com uma junta adaptada à porta. Insira a sonda na câmara de pletismografia e verifique se está a vedação hermética.

Transfira o mouse para a câmara de pletismografia e estenda o tubo de polietileno pela porta superior. Sele a porta usando argila para modelar para fixar o tubo. Verifique a estaque da câmara e instale a câmera como demonstrado anteriormente.

Por fim, avance um filamento de nylon de 0,25 milímetros de diâmetro através de um tubo macio até a cavidade nasal até uma profundidade de zero a três milímetros. Mantenha cinco centímetros do filamento expostos além do tubo portátil. Durante cada estimulação, pressione a extremidade livre do filamento até que ele se curve para aproximadamente 45 graus, aplicando cerca de 0,6 gramas de força à mucosa nasal por um segundo.

Repita a estimulação a cada 30 segundos enquanto registra as respostas de espirro por 10 minutos. Ratos submetidos a cirurgia traqueal ou nasal com estimulação nasal mecânica e desafio traqueal com capsaicina aumentaram significativamente os eventos de espirros e tosse, respectivamente. Registros de pletismografia de corpo inteiro mostraram traços respiratórios de pico simples e duplo para tosse induzida por capsaicina e espirros induzidos mecanicamente.

Oscilogramas sonoros revelaram que o áudio da tosse tinha um pico de intensidade de início abrupto, concentrado na faixa de zero a 30 quilohertz. Enquanto o áudio de espirros crescia progressivamente em intensidade, abrangeva uma faixa de zero a 80 quilohertz e tinha uma duração maior. A fase de compressão das tosses de pico único teve uma média de cerca de 32,39 milissegundos, significativamente menor que as tosses de pico duplo, com cerca de 53,17 milissegundos.

A fase média de compressão dos espirros em picos únicos foi de cerca de 44,03 milissegundos, enquanto os espirros em picos duplos tiveram média em torno de 74,24 milissegundos e foram significativamente mais longos. Padrões de pico único ocorreram em 77,55% das tosses, enquanto apenas 32,42% dos espirros apresentaram picos simples, com padrões de pico duplo dominando em 67,58%. A duração do áudio dos espirros foi significativamente maior que a da tosse, embora com intervalos sobrepostos. A transeção dos espirros sensoriais nasais reduziu significativamente os espirros induzidos pela capsaicina, enquanto a tosse permaneceu inalterada.