Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

Na cela. O citoesqueleto de Acton é uma estrutura dinâmica e sua remodelação é importante em uma variedade de processos, desde a divisão celular, migração celular e transporte físico. Uma grande variedade de proteínas pode se ligar ao citoesqueleto de actina por meio de módulos distintos de ligação à actina.

Neste vídeo, demonstramos o procedimento de ação de co-sedimentação, que é um ensaio in vitro, usado rotineiramente para analisar proteínas ou domínios específicos de proteínas que se ligam à actina filamentosa. Olá, sou Jody Var, do laboratório da Dra. Diane Barber no Departamento de Biologia Celular e Tecidual da UCSF. Neste vídeo, vou mostrar um procedimento de como realizar um ensaio de co-sedimentação de actina.

Este procedimento é um método para analisar proteínas que se ligam especificamente à actina filamentosa e pode ser usado para medir as afinidades de ligação. Este procedimento envolve as seguintes etapas, pré-formação de filamentos de actina e preparação da proteína a ser testada. Incubação de proteína de interesse com actina filamentosa, ou f actina para peletização curta F actina por ultracentrifugação a cem mil páginas GSDS e coloração kuci para visualizar frações de supinato e pellet.

E, finalmente, análise da proteína co-sedimentação com f actina na fração palato. Então vamos começar. Para preparar filamentos de actina, é uma boa prática garantir que a actina com a qual estamos trabalhando esteja na forma mono.

Uma solução de estoque de actina a 10 M por mil é removida do freezer de menos 80 e uma diluição de trabalho de 2,4 mg por mil é feita em um tampão contendo cloreto de cálcio tris, A TP para estabilização de monômeros e DTT. A diluição de trabalho é colocada no gelo por uma hora após uma hora de incubação no gelo. A solução Acton é centrifugada a 14.000 RPM por 10 minutos a quatro graus.

O sutendente resultante será o acton monomérico. Agora, a partir desses monômeros de acton purificados, o acton filamentoso pode ser gerado pela adição de cloreto de potássio, cloreto de magnésio e um TP por uma hora. À temperatura ambiente, a actina filamentosa está agora pronta para incubar com a proteína ou o domínio da proteína de interesse, que mostraremos na próxima etapa.

Para prosseguir com o ensaio de co-sedimentação de actina, devemos preparar a proteína a ser testada. Hoje estou usando o clã, que foi purificado como uma proteína de fusão GSC. A proteína é pré-limpa de agregados por ultracentrifugação e um sup Natin resultante está agora pronto para uso no ensaio.

Para testar a ligação da proteína à actina, a actina deve estar em excesso Aqui, neste caso, 10 microgramas de actina são incubados com cinco microgramas de proteína em um tampão contendo tris, A TP BT ME capto etanol ETTA cloreto de cálcio para produzir um volume total de 150 microlitros para a incubação da proteína actina, as incubações são realizadas diretamente em tubos de ultracentrífuga por uma hora à temperatura ambiente. Os tubos um e dois representam o tubo de controle. Um contém atuando apenas no tubo tampão.

Dois contém proteína apenas no tubo tampão. Três contém tanto a ação quanto a CNU de tailn no tampão dois quatro é um controle adicional para ligação não específica, que contém actina e proteína GST sozinhas. Após a incubação de uma hora, nossas amostras são cuidadosamente colocadas no rotor Beckman.

Em seguida, ajustamos a ultracentrífuga em cem mil G e executamos as amostras por 20 minutos a 22 graus C. Após essa rotação, pudemos preparar nossas amostras para rodar na página SDS. Após a centrifugação de 20 minutos, as amostras são cuidadosamente removidas do rotor para que não sejam perturbadas. Uma marca é feita na lateral do tubo onde o palato está localizado.

Deve-se ter o cuidado de transferir o supinato para tubos einor, aos quais são adicionados cinco tampão de amostra XSCS. Um tampão de amostra XSCS é adicionado ao palato restante nos tubos de ultracentrífuga. Depois de acariciar para cima e para baixo, o palato suspenso Resus é transferido para um tubo de eend orph fresco.

As amostras são então fervidas em um bloco de aquecimento por até 10 minutos. Após a fervura, as amostras são carregadas em um gel de página SDS. Aqui, estou usando um gel de 10% já preparado.

As amostras são cuidadosamente carregadas nos poços na ordem correta. O gel é executado em parafusos constantes por aproximadamente uma hora em temperatura ambiente. Depois que o gel termina de funcionar, nós o coramos com azul de kumasi para visualizar as proteínas.

As soluções azuis de Kumasi devem cobrir o gel completamente. O gel é deixado em uma coqueteleira por pelo menos 20 minutos. Em seguida, a solução azul ESI é removida e o gel é imerso em solução detain.

O gel é deixado para deter por aproximadamente uma hora em um shaker até que as bandas sejam vistas em um gel. Após a coloração de kumasi, o gel pode ser analisado para determinar a quantidade relativa de proteína nas frações supinadas versus palato. Olhando para o gel que reparou nas pistas um e dois, podemos ver as frações snat e pellet de acton sozinho.

Nas pistas três e quatro, tínhamos apenas as frações snat e pellet do C teer tailn. Nas pistas cinco e seis, tivemos as frações snat e pellet do acton e C da cauda e incubação. Nas raias sete e oito, tivemos as frações supinada e palato da incubação da proteína actina e GST.

Como você pode ver, o CT da cauda só é visível na fração do palato na pista seis. Os resultados deste gel indicam uma ligação específica do termo C, a cauda ao acton. Neste vídeo, você viu como realizar um ensaio de co-sedimentação Acton.

Os ensaios de sedimentação Acton Co são um método in vitro para analisar proteínas de ligação ao acton. Ao fazer este procedimento é importante lembrar desses pontos. Para pré-limpar sua proteína de interesse, inclua um controle negativo da proteína sozinha para cada incubação de actina de proteína.

Este controle mostrará se algum dos sedimentos de proteína pré-limpos por conta própria, que a ligação a f agindo por algumas proteínas pode ser sensível à temperatura do pH ou à concentração de sal no tampão. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.