Name: Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprenda o ensaio de co-sedimentação de actina para analisar proteínas que se ligam ao F-actina in vitro. Este método permite estudar interações proteicas no citoesqueleto de células.

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Obrigado a Dr. Praveen Kumar no laboratório Wittman em UCSF para o filme de actina em células HaCAT.

1. Preparação de actina A fonte de actina utilizado neste ensaio foi não-muscular plaquetas humanas (β-actina) obtido a partir de alíquotas Citoesqueleto Inc. Ações em 10 mg / ml são mantidas no congelador -70 º C. Para o ensaio, a actina é diluído a 0,4 mg / ml em tampão contendo 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM ATP e 0,5 mM DTT, centrifugado a 20.000 g por 10 minutos a 4 º C. O sobrenadante, que é actina monomérica está pronto para ser polimerizada. Polimerização de actina é induzida pela adição de 50 mM KCl, 1 mM de ATP e 2 mM MgCl 2. A polimerização ocorre em temperatura ambiente por 1 hora. 2. Preparação de proteínas Neste ensaio, estamos usando o C-terminal de talina, que foi purificada como uma proteína GST-marcados. A proteína a ser utilizada no ensaio é submetido a uma centrifugação de alta velocidade para pré-claro dos agregados antes da incubação com F-actina. A proteína é girada a 100.000 g em uma ultracentrífuga Beckman por 20 minutos a 22 º C. 3. Actina-proteína Incubação A quantidade de actina e proteína em um ensaio irá variar. Neste exemplo estamos usando actina em excesso. Normalmente, uma relação molar é calculado, por exemplo. uma proporção de 4:1 molar de actina à proteína. No ensaio seguinte, o volume final de reação é de 150 mL. O buffer em que a proteína e F-actina são incubados dependerá da proteína a ser testado e sobre as condições exigidas. Neste exemplo, usamos uma solução tampão contendo 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM de ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2 e 2 mM MgCl 2. A proteína e F-actina são incubados no buffer por 1 hora à temperatura ambiente. 4. Sedimentação de F-actina Após a incubação, as amostras são giradas em 100.000 g a 22 º C. Nós usamos uma ultracentrífuga Beckman no vídeo. O rotor é cuidadosamente removida para não atrapalhar as pelotas. 5. Análise de proteínas co-sedimentação com F-actina Os sobrenadantes são cuidadosamente removidas por pipetagem em um tubo eppendorf e 5 X tampão de amostra Laemmli SDS-PAGE é adicionado. Um volume adequado de um tampão de amostra Laemmli X SDS-PAGE é adicionado à pellets restantes, pipetados cima e para baixo, e transferidos para novos tubos eppendorf. A quantidade relativa de proteína na pellets e sobrenadantes são analisados ​​após a sua separação por SDS-PAGE e coloração Coomassie azul do gel ou Western blotting. A fim de determinar a especificidade de interação da proteína com a actina, actina dependente da concentração co-sedimentações pode ser realizada. Para este tipo de experimento, uma quantidade fixa de proteína e uma série de quantidades crescentes de actina são incubados, ea análise é realizada como descrito acima.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

Actina co-sedimentação é um simples ensaio in vitro para analisar proteínas specfic ligação a F-actina. Neste vídeo, demonstramos um exemplo de como um simples actina co-sedimentação pode ser realizada. Vamos mostrar como preparar F-actina, prepare a proteína a ser testada e do procedimento de actina co-sedimentação. Um número de pontos devem ser considerados na realização de actina co-sedimentação ensaios. Por exemplo, os componentes do tampão para a incubação pode variar de acordo com a proteína a ser testada e pH, temperatura e concentra...

actina ensaio co sedimentação; para a análise da proteína de ligação a f-actina

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

O citoesqueleto de actina no interior da célula é uma rede de filamentos de actina que permite o movimento de células e processos celulares, e que gera tensão e ajuda a manter a forma celular. Embora o citoesqueleto de actina é uma estrutura rígida, é uma estrutura dinâmica que está em constante remodelação. Uma série de proteínas pode se ligar ao citoesqueleto de actina. A ligação de uma proteína particular para F-actina é muitas vezes desejada para suporte de células observações biológicas ou para entender melhor os processos dinâmicos, devido à remodelação do citoesqueleto de actina. O ensaio de actina co-sedimentação é um ensaio in vitro rotineiramente usados ​​para analisar a ligação de proteínas específicas ou domínios de proteína com F-actina. Os princípios básicos do ensaio envolve um período de incubação da proteína de interesse (comprimento total ou de domínio de) com F-actina, passo ultracentrifugação para pellet F-actina e análise da proteína co-sedimentação com F-actina. Actina co-sedimentação ensaios podem ser desenvolvidos de acordo com medida afinidades de ligação de actina e ensaios na competição.

Proteínas se ligam à actina filamentosa (F-actina) através de módulos de actina de ligação distinto. Neste vídeo podemos demonstrar o procedimento de actina co-sedimentação, que é um ensaio in vitro rotineiramente usado para analisar proteínas ou domínios específicos que se ligam F-actina.

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

O citoesqueleto de actina dentro da célula é uma rede de filamentos de actina que permite a movimentação das células e processos celulares, e que gera ...

No interior da célula. O citoesqueleto de actina é uma estrutura dinâmica, e sua remodelação é importante em diversos processos, como divisão celular, migração celular e transporte físico. Uma grande variedade de proteínas pode se ligar ao citoesqueleto de actina por meio de módulos distintos de ligação à actina.Neste vídeo, demonstramos o procedimento de co-sedimentação com actina, um ensaio in vitro amplamente utilizado para analisar proteínas ou domínios específicos de proteínas que se ligam à actina filamentosa. Olá, sou Jody Var do laboratório da Dra. Diane Barber, do Departamento de Biologia Celular e Tecidual da UCSF. Neste vídeo, vou mostrar a vocês o procedimento para realizar um ensaio de co-sedimentação com actina.Este procedimento é um método para analisar proteínas que se ligam especificamente à actina filamentosa e pode ser usado para medir afinidades de ligação. Este procedimento envolve as seguintes etapas: formação de filamentos de actina e preparação da proteína a ser testada. Incubação da proteína de interesse com actina filamentosa, ou f-actina, por curto período, seguida pela centrifugação ultracentrífuga da f-actina a cem mil ×g, eletroforese em gel SDS-PAGE e coloração com Coomassie para visualizar as frações do sobrenadante e do pellet.E finalmente, a análise da proteína que co-sedimenta com o F-actina na fração do palato. Então vamos começar. Para preparar filamentos de actina, é uma boa prática garantir que a actina com a qual estamos trabalhando esteja na forma monomérica.Uma solução estoque de actina a 10 M por mil é retirada do congelador a menos 80 e uma diluição de trabalho a 2,4 mg por mil é preparada em um tampão contendo tris cloreto de cálcio, ATP para estabilização do monômero e DTT. A diluição de trabalho é colocada no gelo por uma hora após uma hora de incubação no gelo. A solução de actina é centrifugada a 14.000 RPM durante 10 minutos a quatro graus.O sobrenadante resultante será a actina monomérica. Agora, a partir desses monômeros de actina purificados, pode-se gerar actina filamentosa pela adição de cloreto de potássio, cloreto de magnésio e ATP por uma hora. À temperatura ambiente, a actina filamentosa está pronta para ser incubada com a proteína ou domínio proteico de interesse, o que mostraremos a você no próximo passo.Para prosseguir com o ensaio de co-sedimentação de actina, devemos preparar a proteína a ser testada. Hoje estou utilizando o clan, que foi purificado como uma proteína de fusão GSC. A proteína é pré-limpa de agregados por ultracentrifugação e um sobrenadante resultante está agora pronto para ser usado no ensaio.Para testar a ligação da proteína à actina, a actina deve estar em excesso. Neste caso, 10 microgramas de actina são incubados com cinco microgramas de proteína em um tampão contendo tris, A TP BT ME etanol capto, ETTA e cloreto de cálcio, resultando em um volume total de 150 microlitros para a incubação da proteína com a actina. As incubações são realizadas diretamente em tubos de ultracentrífuga por uma hora à temperatura ambiente. Os tubos um e dois representam controles; o tubo um contém apenas actina no tampão.Dois contém apenas proteína no tubo de tampão. Três contém actina e a CNU da talina no tampão dois. Quatro é um controle adicional para ligação não específica, que contém actina e proteína GST isoladamente. Após a incubação de uma hora, nossas amostras são cuidadosamente colocadas no rotor Beckman.Em seguida, ajustamos a ultracentrífuga em cem mil G e centrifugamos as amostras por 20 minutos a 22 graus C. Após essa centrifugação, fomos capazes de preparar nossas amostras para corrida em gel de SDS-PAGE. Após os 20 minutos de centrifugação, as amostras são cuidadosamente removidas do rotor para que o sedimento não seja perturbado. Uma marca é feita na lateral do tubo indicando onde se localiza o sedimento.Tem-se o cuidado de transferir o sobrenadante para tubos eppendorf aos quais é adicionado tampão amostral XSCS 5X. Tampão amostral 1X é adicionado ao precipitado remanescente nos tubos de ultracentrifugação. Após pipetar para cima e para baixo, o precipitado suspenso é transferido para um tubo eppendorf novo.As amostras são então fervidas em um bloco de aquecimento por até 10 minutos. Após a fervura, as amostras são carregadas em um gel de SDS-PAGE. Aqui, estou usando um gel pré-fabricado de 10%.As amostras são cuidadosamente carregadas nas pocas na ordem correta. O gel é eletroforético a volts constantes por aproximadamente uma hora à temperatura ambiente. Após a conclusão da corrida eletroforética, coramos o gel com azul de kumasi para visualizar as proteínas.As soluções azuis Kumasi devem cobrir completamente o gel. O gel permanece em agitação por pelo menos 20 minutos. Em seguida, a solução azul ESI é removida e o gel é imerso na solução de destinte.O gel é deixado para repousar por aproximadamente uma hora em um agitador, até que as bandas sejam visíveis em um gel. Após a coloração com kumasi, o gel pode ser analisado para determinar a quantidade relativa de proteína nas frações sobrenadante e pellet. Observando o gel que se recuperou nas linhas um e duas, podemos ver as frações sobrenadante e pellet da actina isolada.Nas pistas três e quatro, tivemos as frações de sobrenadante e pellet da cauda de C teer tailn isolada. Nas pistas cinco e seis, tivemos as frações de sobrenadante e pellet da actina e C da cauda e incubação. Nas pistas sete e oito, tivemos as frações de sobrenadante e pellet da incubação da actina e da proteína GST.Como é possível observar, o CT da cauda é visível apenas na fração do palato na trilha seis. Os resultados deste gel indicam uma ligação específica do termo C, a cauda, com a actina. Neste vídeo, você acompanhou como realizar um ensaio de co-sedimentação com actina.Os ensaios de sedimentação por centrifugação em gradiente de sacarose são um método in vitro para analisar proteínas que ligam actina. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar destes pontos. Pré-limpe a proteína de interesse e inclua um controle negativo com a proteína isolada para cada incubação de proteína com actina.Este controle mostrará se alguma das proteínas pré-limpa sedimenta por si só, pois a ligação à f actina por algumas proteínas pode ser sensível ao pH, à temperatura ou à concentração de sal no tampão. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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