Name: Extração de RNA Baseada em Fenol Quente Otimizada de Micobactérias: Uma Abordagem Robusta para Análise Confiável de Expressão Gênica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-11T13:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a extrair RNA de alta qualidade de micobactérias usando o protocolo otimizado de fenol quente. Este método acessível e de baixo custo é ideal para estudos transcriptômicos em larga escala de Mycobacterium tuberculosis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gostaria de agradecer o apoio do Departamento de Biotecnologia (DBT), Conselho Indiano de Pesquisas Médicas (ICMR) e Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB).

Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Cultivo de Mycobacterium
<ol>
	<li>Inocule 1 mL do estoque glicerinado de Msmeg ou Mtb em 10 mL de meio Middlebrook 7H9 suplementado com 0,2% de glicerol, 0,05% de Tween 80 e 10% de ADC a 37 °C com agitação a 150 rpm até que a DO atinja 1–1,5.</li>
	<li>Cultive a cultura secundária adicionando 1% da cultura primária em 10 mL de meio 7H9 até a fase logarítmica média, com DO600nm = 0,6–0,7.</li>
	<li>Divida em alíquotas de 3 mL e centrifugue as culturas a 2000 x g por 5 min à temperatura ambiente (23–25 °C).</li>
	<li>Armazene os pellets a -80 °C até a extração de RNA. 
	CAUTION: Para culturas de Mtb, siga as diretrizes adequadas de BSL3 e inative o pellet por calor a 95 ˚C por 20–25 min. 
	NOTE: Figura 1 mostra o fluxograma das etapas básicas seguidas durante a extração de RNA pelo método do fenol quente.</li>
</ol>
<img alt="Diagrama do método de extração de RNA com fenol quente com etapas; ensaio transcricional; integridade de RNA no Qubit; análise." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig1.jpg" data-altupdatedat="1791864094000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Representação esquemática do método de Fenol Quente e sua análise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
2. Extração de RNA
<ol>
	<li>Método do fenol quente (método FQ)
	<ol>
		<li>Adicione 200 µL de tampão TES (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 5 mM EDTA, pH 8,0; 0,1 M NaCl; % SDS; 1% β-mercaptoetanol) ao pellet celular e ressuspenda o pellet por vortex. </li>
		<li>Adicione aproximadamente 0,1 g de esferas de sílica de 0,1 mm à amostra. Use um homogeneizador manual de tecidos por 10–15 s até que o pellet esteja completamente descongelado em gelo. Repita este passo por mais 2 ciclos, seguido por congelamento rápido em nitrogênio líquido após cada repetição.</li>
		<li>OU use um ruptor de esferas de bancada de alta velocidade por 1 min a uma velocidade de 5 (5,0 m/s) à temperatura ambiente. Repita este passo por 3 ciclos e incube a amostra em gelo para evitar aquecimento após cada ciclo. 
		NOTA: Repita a lise de células de Mtb por 6–8 ciclos (cada ciclo por 1 min) com um homogeneizador manual de tecidos ou um ruptor de esferas, resfriando intermitentemente em gelo após cada ciclo. Use água tratada com DEPC (diethylpirocarbonato) para a preparação de todos os tampões e reagentes necessários para a extração de RNA.</li>
		<li>Adicione 200 µL adicionais de tampão TES (pré-aquecido a 65 °C) a cada amostra para completar o volume até 400 µL. A cada amostra, adicione 200 µL de fenol ácido (fenol equilibrado com tampão de citrato 100 mM, pH 4,5) e 200 µL de clorofórmio (misture o fenol ácido e o clorofórmio em proporção igual antes de adicioná-los à amostra).</li>
		<li>Incube a amostra a 65 °C em um bloco térmico com agitação a 900 rpm por 30 min e centrifugue a 12000 x g por 15 min à temperatura ambiente. Assegure uma separação adequada de fases após a centrifugação (uma fase aquosa superior clara contendo RNA, uma interfase distinta de DNA e uma fase orgânica inferior contendo proteínas e lipídios será observada).</li>
		<li>Remova a camada superior da fase aquosa e transfira-a para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mL. Adicione novamente um volume igual de fenol ácido:clorofórmio. Centrifugue a 12.000 x g por 15 min à temperatura ambiente. Assegure uma separação adequada de fases.</li>
		<li>Transfira a camada aquosa superior para um tubo microcentrífugo novo de 1,5 mL, então adicione 30 µL de tampão de acetato de sódio 3 M, pH 5,3, e 240 µL de isopropanol gelado. Incube a −80 °C por 30 min a 1 h. 
		NOTA: O tubo microcentrífugo pode ser armazenado durante a noite a -80 °C nesta etapa. Sobreponha o tubo microcentrífugo com várias camadas de parafilm para evitar que se abra a 65 °C durante a incubação. 
		CAUTELA: Fenol e clorofórmio são substâncias químicas perigosas; portanto, devem ser seguidos os equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, controles de engenharia como capelas de exaustão e procedimentos específicos de descarte de resíduos.</li>
		<li>Centrifugue a 12.000 x g por 1 h à temperatura ambiente. Assegure a formação do pellet e remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet.</li>
		<li>Ressuspenda o pellet em 1 mL de etanol 75% e centrifugue a 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Realize este passo duas vezes e seque o pellet ao ar.</li>
		<li>Ressuspenda o pellet em 50 µL de água livre de nucleases. 
		​NOTA: Para dissolver o RNA, incube-o em água livre de RNase por 10–30 min à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Método TRIzol
	<ol>
		<li>Adicione 200 µL do reagente TRIzol ao pellet celular. 
		CAUTELA: O TRIzol é uma substância química perigosa; portanto, devem ser seguidos os equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, controles de engenharia como capelas de exaustão e procedimentos específicos de descarte de resíduos.</li>
		<li>Siga o método de lise celular conforme os passos 2.1.2 - 2.1.3.</li>
		<li>Adicione 200 µL adicionais de reagente TRIzol, seguido por 200 µL de clorofórmio, e vortex por 1 min. Centrifugue a 13.400 x g por 15 min a 4 °C. Assegure a separação adequada de fases após a centrifugação.</li>
		<li>Transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mL.</li>
		<li>Precipite o RNA adicionando 500 µL de isopropanol à fase aquosa e incube a −80 °C por 30 min a 1 h.</li>
		<li>Pelotize o RNA por centrifugação a 15.000 x g por 20 min a 4 °C. Observe cuidadosamente o pellet e remova o sobrenadante sem perturbá-lo.</li>
		<li>Ressuspenda o pellet com 1 mL de etanol 75% e centrifugue a 13.400 x g por 1 min a 4 °C. Repita este passo duas vezes, seque o pellet ao ar por 30 min à temperatura ambiente e ressuspenda em 50 µL de água livre de nucleases.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Método com kit comercialmente disponível para extração de RNA
	<ol>
		<li>Ressuspenda o pellet celular em 200 µL de tampão de ressuspensão (fornecido no kit).</li>
		<li>Siga o método de lise celular conforme os passos 2.1.2 - 2.1.3.</li>
		<li>Realize o experimento subsequente conforme as instruções do fabricante.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Tratamento com DNase, quantificação e visualização
<ol>
	<li>Para remover a contaminação por DNA genômico, adicione 1 µL de DNase I (10 unidades) e 5 µL de tampão RDD (1x) a cada amostra de RNA e incube à temperatura ambiente por 30 min.</li>
	<li>Quantifique a amostra de RNA espectrofotometricamente usando Nanodrop e a integridade do RNA usando um Qubit4. O valor aceitável de RIN está entre 7,5 e 10. Os valores aceitáveis de A260/A280 e A260/A230 estão na faixa de 1,8–2,0 e 2,0–2,2, respectivamente.</li>
	<li>Visualize o RNA em gel de agarose a 1% utilizando corante de carregamento de RNA 1X.</li>
</ol>
4. Síntese de cDNA e PCR quantitativa em tempo real
<ol>
	<li>Prepare uma reação de 20 µL para a preparação de cDNA utilizando o kit de Transcrição Reversa de cDNA e 1 µg de RNA, seguindo as instruções do fabricante em um termociclador.</li>
	<li>Prepare uma reação de PCR em tempo real de 10 µL utilizando 50 ng de cDNA, 0,4 µM de cada par de primers e SYBR de acordo com as instruções do fabricante. Execute a amostra no termociclador de PCR em Tempo Real. 
	OBSERVAÇÃO: Os seguintes primers foram utilizados para análise de qPCR: 
	Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3' 
	Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3' 
	Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3' 
	Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3' 
	Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3' 
	Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'</li>
</ol>
5. Análise estatística
<ol>
	<li>Realize um teste t de Student com todas as réplicas biológicas utilizando o Graph Pad Prism; valores de P ≤ 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As barras de erro representam o erro padrão de pelo menos três réplicas biológicas.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+tuberculosis+report%2C+2024%22">Global tuberculosis report, 2024</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/b/74877">https://www.who.int/publications/b/74877</a> (2024).</li>
<li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-resistant+tuberculosis%3A+An+update+on+disease+burden%2C+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment.</a> Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).</li>
<li>Tailleux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+host-pathogen+cross-talk+by+transcriptional+profiling+of+both+Mycobacterium+tuberculosis+and+infected+human+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages.</a> PLoS One. 3 (1), e1403(2008).</li>
<li>Voskuil, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+respiration+by+nitric+oxide+induces+a+Mycobacterium+tuberculosis+dormancy+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program.</a> J Exp Med. 198 (5), 705-713 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., Yew, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+drug+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tuberc+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> Int J Tuberc Lung Dis. 13 (11), 1320-1330 (2009).</li>
<li>Arnvig, K. B., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+RNAs+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of small RNAs in Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 73 (3), 397-408 (2009).</li>
<li>Brennan, P. J., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+envelope+of+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The envelope of mycobacteria.</a> Annu Rev Biochem. 64, 29-63 (1995).</li>
<li>Belisle, J. T., Sonnenberg, M. G. Isolation of genomic DNA from mycobacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBelisle%2C+JT+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. 101, 31-44 (1998).</li>
<li>Manganelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracytoplasmic-function+sigma+factor+%CF%83H+in+Mycobacterium+tuberculosis+global+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of the extracytoplasmic-function sigma factor σH in Mycobacterium tuberculosis global gene expression.</a> Mol Microbiol. 45 (2), 365-374 (2002).</li>
<li>Rustad, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+stability+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).</li>
<li>Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+of+RNA+extraction+from+bacteria+refractory+to+disruption%2C+including+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria.</a> Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).</li>
<li>Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+efficient+method+for+the+isolation+of+DNA-free%2C+pure+and+intact+RNA+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis.</a> J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).</li>
<li>Hiebert, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+extraction+and+RNA-sequencing+method+for+transcriptomic+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis.</a> Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).</li>
<li>Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine-rich+peptides+potently+bind+ESAT6%2C+a+virulence+determinant+of+Mycobacterium+tuberculosis%2C+and+concurrently+affect+the+pathogen%27s+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth.</a> PLoS One. 4, e7615(2009).</li>
<li>Alli, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+RNA+extraction+in+Mycobacterium+tuberculosis+for+studying+intracellular+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Clin+Exp+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression.</a> Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).</li>
</ol>

Não houve conflitos de interesses entre os autores. Todos os autores aprovaram a submissão.

Para desenvolver um método simples e robusto de extração de RNA para Mycobacterium, o método do fenol quente foi otimizado. Posteriormente, o RNA extraído foi comparado com duas abordagens amplamente utilizadas: TRIzol e um método baseado em coluna em kit12,13. Essas técnicas foram comparadas com base no rendimento, pureza, integridade, custo e tempo de processamento do RNA, a fim de avaliar sua praticidade para aplicações moleculares subsequentes. Tanto...

M. tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose (TB), continua sendo a principal causa de morte por um único patógeno infeccioso, superando o HIV/AIDS. Em 2024, a TB foi responsável por aproximadamente 1,3 milhão de mortes em todo o mundo1. Esse ônus é agravado pelo aumento da prevalência de cepas resistentes a múltiplas drogas (RMD) e resistentes a drogas extensivamente (XDR). Portanto, há uma necessidade urgente de compreender a base molecular da patogênese da TB e identificar novos alvos terapêuticos2.
O perfilamento transcricional de Mtb tornou-se uma ferramenta importante para elucidar elementos funcionais envolvidos nas interações hospedeiro-patógeno3, adaptação ao estresse ambiental4 e mecanismos subjacentes à resistência a medicamentos5. Metodologias avançadas, como PCR em tempo real, microarranjos e sequenciamento de RNA (RNA-seq), aumentaram significativamente a capacidade de analisar o transcriptoma micobacteriano6. No entanto, o sucesso desses métodos depende fortemente da disponibilidade de RNA de alta qualidade, o que, por sua vez, depende da lise celular eficiente durante a extração. A parede celular complexa de Mtb, composta por micolil–arabinogalactana–peptidoglicano, torna a extração de RNA particularmente difícil7. Técnicas de lise existentes, incluindo hidrólise enzimática8, sonicação9 e batimento com esferas10, frequentemente exigem equipamentos caros e grandes volumes de cultura, limitando sua praticidade em muitos laboratórios BSL-3. Além disso, a taxa de crescimento lenta de Mtb exige tempos prolongados de cultivo para obter biomassa suficiente11.
Para superar essas limitações, foi desenvolvido um método otimizado de extração de RNA baseado em fenol quente que é rápido e econômico. Utilizando apenas 3 mL de cultura na fase logarítmica média, o método fornece 45–60 µg de RNA de alta qualidade adequado para análises transcritômicas subsequentes. A lise celular é realizada usando um moinho de tecidos compacto e de uso manual, juntamente com reagentes facilmente disponíveis, eliminando a necessidade de instrumentos caros. Embora o método de fenol quente já tenha sido descrito anteriormente11,12, a versão otimizada melhora a praticidade, a relação custo-benefício e o rendimento de RNA. A otimização foi realizada utilizando M. smegmatis mc2155 (Msmeg) e validada com sucesso com Mtb H37Rv.

<table><tbody><tr><td>esferas de sílica de 0,1 mm</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP116911050</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 4&amp;nbsp;</td><td>revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga fria</td><td>ThermoScientific</td><td>42541217</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>sigma</td><td>E02SS</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>SRL</td><td>62889</td><td></td></tr><tr><td>bloco térmico</td><td>MIULAB</td><td>MU-E02-1049</td><td></td></tr><tr><td>kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>moinho de tecidos motorizado G10</td><td>Coron</td><td>G22616008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Nanofotômetro N50&amp;nbsp;</td><td>IMPLEM</td><td>T51601</td><td></td></tr><tr><td>fenol equilibrado com tampão de citrato 0,1 M, pH 4,5</td><td>Sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>fluorímetro Qubit 4&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2.32262E+12</td><td></td></tr><tr><td>ciclador térmico de PCR em tempo real</td><td>Analytik Jena AG</td><td>844-00503-2</td><td></td></tr><tr><td>kit RNA easy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>acetato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>ciclador térmico&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>621BR29739</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRI</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>base de Tris</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>516732</td><td></td></tr></tbody></table>

extração de rna baseada em fenol quente otimizada de micobactérias: uma abordagem robusta para análise confiável de expressão gênica

Optimized Hot Phenol&#8211;Based RNA Extraction from Mycobacteria: A Robust Approach for Reliable Gene Expression Analysis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) continua sendo uma grande ameaça à saúde global, destacando a necessidade de estudos transcriptômicos confiáveis para compreender sua biologia e mecanismos de resistência a medicamentos. Essas análises dependem da obtenção de RNA de alto rendimento e alta qualidade. Embora diversos métodos de extração de RNA estejam disponíveis, muitos exigem reagentes caros, grandes volumes de cultura ou equipamentos especializados, o que limita sua adequação para estudos em larga escala, especialmente em ambientes com recursos limitados. Aqui, apresenta-se um método otimizado de extração de RNA baseado em fenol quente, especificamente adaptado para micobactérias. O método utiliza volume mínimo de cultura e reagentes comumente disponíveis, gerando consistentemente RNA de alta qualidade, adequado para aplicações transcriptômicas de alto rendimento. A quantidade e integridade do RNA foram avaliadas por eletroforese em gel e análise de integridade do RNA (RIN), e sua adequação para aplicações posteriores foi confirmada por qPCR e Qubit 4. Para comparar o desempenho do método otimizado, realizou-se uma extração paralela de RNA utilizando TRIzol e RNeasy em condições experimentais idênticas, incluindo a mesma espécie de Mycobacterium, volume de cultura, fase de crescimento (logarítmica e estacionária) e condições de lise. Isso permitiu uma comparação direta de rendimento, qualidade, viabilidade e custo. O método otimizado de fenol quente demonstrou rendimento e qualidade de RNA comparáveis ou superiores, reduzindo significativamente o custo dos reagentes e a dependência de equipamentos especializados. Devido à sua eficiência, reprodutibilidade e baixo custo, este protocolo oferece uma alternativa prática para estudos em larga escala de expressão gênica e transcriptômica em Mtb e outras espécies de micobactérias.

Qualidade e rendimento do RNA
A qualidade e quantidade do RNA foram avaliadas por eletroforese em gel de agarose (Figura 2). Bandas distintas e nítidas correspondentes ao rRNA 23S e 16S foram observadas em todos os métodos de extração, confirmando o isolamento bem-sucedido de RNA total. Os métodos Hot Phenol e TRIzol apresentaram três bandas claras representando o rRNA 23S (~2900 pb), 16S (~1500 pb) e 5S (~120 pb), indicando RNA i...

Este estudo otimiza um método de extração de RNA baseado em fenol quente para Mycobacterium, obtendo RNA de alta qualidade adequado para análises transcriptômicas. Quando comparado com TRIzol e RNeasy em condições idênticas, o método proporcionou maior rendimento, integridade comparável e melhor eficiência de custo, oferecendo uma alternativa prática para estudos de expressão gênica em larga escala.

Extração de RNA Baseada em Fenol Quente Otimizada de Micobactérias: Uma Abordagem Robusta para Análise Confiável de Expressão Gênica

O *Mycobacterium tuberculosis* (Mtb) continua a ser uma grande ameaça à saúde global, ressaltando a necessidade de estudos transcriptômicos confiáveis para compreender a sua biologia...

Nossa pesquisa concentra-se na análise de transcriptoma da adaptação micobacteriana no microambiente do hospedeiro, utilizando um método confiável e eficiente de extração de RNA. Este protocolo rápido, confiável e otimizado utiliza produtos químicos de uso rotineiro e instrumentação mínima, superando os desafios técnicos associados à extração de RNA de alta qualidade de micobactérias. Para começar, inocular um mililitro de cultura de glicerol de Mycobacterium smegmatis ou Mycobacterium tuberculosis em 10 mililitros de meio Middlebrook 7H9, suplementado com 0,2% de glicerol, 0,05% de Tween 80 e 10% de albumina-dextrose-catalase.Incubar a 37 graus Celsius com agitação a 150 rotações por minuto até que a densidade óptica atinja de um a 1,5 para obter o cultivo primário. Para obter o cultivo secundário, adicionar 1% do cultivo primário a 10 mililitros de meio 7H9 e incubar até que o cultivo atinja a fase logarítmica média, com densidade óptica de 0,6 a 0,7 a 600 nanômetros. Dividir o cultivo em alíquotas de três mililitros e centrifugar a 2.000 ×g por cinco minutos a 23 a 25 graus Celsius.Em seguida, prossiga para a extração de RNA. Para o método com fenol quente, adicione 200 microlit

optimized-hot-phenolbased-rna-extraction-from-mycobacteria-robust

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós apresentamos um método para gerar cDNA de mRNA ambiental. Em geral, o total de RNA é a primeira coletados do ambiente, rRNA é seletivamente removido, mRNA é seletivamente amplificado, e cDNA sintetizado a partir do pool de mRNA enriquecido é seqüenciado. Seqüências recuperadas podem ser anotados usando técnicas padrão de bioinformática para identificar os genes expressos.

Analisando Expressão Gênica de comunidades microbianas Marinha usando transcriptômica Ambiental

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Microdissecção tem sido extensivamente utilizada para a análise de DNA, RNA e proteínas dentro do tecido. Microscopia captura a laser (LCM) é o método mais comumente utilizado, mas uma nova técnica de fresagem, mesodissection, é recentemente disponível. Demonstramos extração de RNA a partir de mesodissected formalina parafina fixo lâminas de tecido embebidos de Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; transcritos específicos de formalina fixo Parafina incorporado Lung granulomas

Este manuscrito descreve o uso de tecnologia de ponta fornecida por microarrays de DNA. Os microarrays fornecem uma visão geral das alterações transcriptômicas em bactérias incorridas sob uma condição específica. Além disso, destacamos a facilidade com que grandes quantidades de dados podem ser analisadas usando pacotes de software desenvolvidos internamente convenientes.

A Pipeline rápido e confiável para estudo de Análise de Caso bacteriana transcriptoma: Regulamento Gene Serina-dependente em<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Desenvolvemos um protocolo rápido, sensível e reprodutível para o perfil de expressão gênica de patógenos durante uma infecção.

Gene Expression Profiling de micróbios Contaminando utilizando uma plataforma digital de codificação em barra

Nós descrevemos um método eficiente, robusto e de baixo custo para extração de ácidos nucleicos de cotonetes para a caracterização das comunidades bacterianas usando 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento. O método permite uma abordagem comum para processamento de múltiplos tipos de amostras e acomoda uma série de processos analíticos jusante.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

as interações RNA-proteína estão no centro de muitos processos celulares. Aqui, descrevemos um método in vivo para isolar RNA específico e identificar novas proteínas associadas a ele. Isso pode lançar uma nova luz sobre como os RNAs são regulados na célula.

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

Aqui, apresentamos dois protocolos para estudar interações do fagócito -Mycobacterium abscessus : a triagem de uma biblioteca de transposon mutant para deficiência intracellular bacteriana e a determinação de bactérias intracelular transcriptoma do RNA sequenciamento. Ambas as abordagens fornecem insights sobre as vantagens genômicas e adaptações de transcriptomic melhorar a aptidão de bactérias intracelulares.

Identificação de marcadores de virulência de Mycobacterium abscessus para replicação intracelular em fagócitos

O sequenciamento de RNA de quantificação absoluta (AQRNA-seq) é uma tecnologia desenvolvida para quantificar a paisagem de todos os pequenos RNAs em misturas biológicas. Aqui, as etapas de preparação da biblioteca e processamento de dados do AQRNA-seq são demonstradas, quantificando as mudanças no pool de RNA de transferência (tRNA) em Mycobacterium bovis BCG durante a dormência induzida por fome.

AQRNA-seq para quantificar RNAs pequenos

Este protocolo mostra que o batimento de contas combinado com a purificação de esferas de captura de DNA fornece um método rápido e consistente para extrair DNA de amostras de Mycobacterium tuberculosis , tornando-o uma escolha eficaz para aplicações de sequenciamento de próxima geração.

Extração de DNA micobacteriano usando batimento de grânulos em tampão personalizado seguido de fluxo de trabalho NGS

Aprenda a extrair RNA de alta qualidade de micobactérias usando o protocolo otimizado de fenol quente. Este método acessível e de baixo custo é ideal para estudos transcriptômicos em larga escala de Mycobacterium tuberculosis.

Extração de RNA Baseada em Fenol Quente Otimizada de Micobactérias: Uma Abordagem Robusta para Análise Confiável de Expressão Gênica (Vídeo) | JoVE Journal

Extração de RNA Baseada em Fenol Quente Otimizada de Micobactérias: Uma Abordagem Robusta para Análise Confiável de Expressão Gênica

Explorar mais vídeos