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Gostaria de agradecer o apoio do Departamento de Biotecnologia (DBT), Conselho Indiano de Pesquisas Médicas (ICMR) e Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB).

Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Cultivo de Mycobacterium
<ol>
	<li>Inocule 1 mL do estoque glicerinado de Msmeg ou Mtb em 10 mL de meio Middlebrook 7H9 suplementado com 0,2% de glicerol, 0,05% de Tween 80 e 10% de ADC a 37 °C com agitação a 150 rpm até que a DO atinja 1–1,5.</li>
	<li>Cultive a cultura secundária adicionando 1% da cultura primária em 10 mL de meio 7H9 até a fase de crescimento exponencial médio, com DO600nm = 0,6–0,7.</li>
	<li>Divida em alíquotas de 3 mL e centrifugue as culturas a 2000 x g por 5 min à temperatura ambiente (23–25 °C).</li>
	<li>Armazene os pellets a -80 °C até a extração de RNA. 
	CAUTION: Para culturas de Mtb, siga as diretrizes adequadas de BSL3 e inative o pellet por calor a 95 ˚C por 20–25 min. 
	NOTE: Figura 1 mostra o fluxograma dos passos básicos seguidos durante a extração de RNA pelo método do fenol quente.</li>
</ol>
<img alt="Diagrama da extração de RNA com fenol quente; fluxo de trabalho mostra centrifugação, separação de fases e análise da integridade do RNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig1.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Representação esquemática do método de fenol quente e da análise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
2. Extração de RNA
<ol>
	<li>Método do fenol quente (método FQ)
	<ol>
		<li>Adicione 200 µL de tampão TES (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 5 mM EDTA, pH 8,0; 0,1 M NaCl; % SDS; 1% β-mercaptoetanol) ao pellet celular e ressuspenda o pellet por vortexamento.</li>
		<li>Adicione aproximadamente 0,1 g de esferas de sílica de 0,1 mm à amostra. Use um homogeneizador manual de tecidos por 10–15 s até que o pellet esteja completamente descongelado em gelo. Repita este passo por mais 2 ciclos, seguido por congelamento rápido em nitrogênio líquido após cada repetição.</li>
		<li>OU utilize um ruptor de esferas de bancada de alta velocidade por 1 min a uma velocidade de 5 (5,0 m/s) em temperatura ambiente. Repita este passo por 3 ciclos e incube a amostra em gelo para evitar aquecimento após cada ciclo. 
		NOTA: Repita a lise de células de Mtb por 6–8 ciclos (cada ciclo por 1 min) com um homogeneizador manual de tecidos ou um ruptor de esferas, resfriando intermitentemente em gelo após cada ciclo. Use água tratada com DEPC (diethylpirocarbonato) para o preparo de todos os tampões e reagentes necessários para a extração de RNA.</li>
		<li>Adicione 200 µL adicionais de tampão TES (pré-aquecido a 65 °C) a cada amostra para completar o volume até 400 µL. A cada amostra, adicione 200 µL de fenol ácido (fenol equilibrado com tampão de citrato 100 mM, pH 4,5) e 200 µL de clorofórmio (misture o fenol ácido e o clorofórmio em proporção igual antes de adicioná-los à amostra).</li>
		<li>Incube a amostra a 65 °C em um bloco térmico com agitação a 900 rpm por 30 min e centrifugue a 12000 x g por 15 min em temperatura ambiente. Assegure uma separação adequada de fases após a centrifugação (uma fase aquosa superior clara contendo RNA, uma interfase distinta de DNA e uma fase orgânica inferior contendo proteínas e lipídios será observada).</li>
		<li>Remova a camada superior da fase aquosa e transfira-a para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mL. Adicione novamente um volume igual de fenol ácido:clorofórmio. Centrifugue a 12.000 x g por 15 min em temperatura ambiente. Assegure uma separação adequada de fases.</li>
		<li>Transfira a camada aquosa superior para um tubo microcentrífugo novo de 1,5 mL, adicione então 30 µL de tampão de acetato de sódio 3 M, pH 5,3, e 240 µL de isopropanol gelado. Incube a −80 °C por 30 min a 1 h. 
		NOTA: O tubo microcentrífugo pode ser armazenado durante a noite a -80 °C nesta etapa. Sobreponha o tubo microcentrífugo com várias camadas de parafilm para evitar que se abra a 65 °C durante a incubação. 
		CAUTELA: Fenol e clorofórmio são substâncias químicas perigosas; portanto, devem ser seguidos os equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, controles de engenharia como capelas de exaustão e procedimentos específicos de descarte de resíduos.</li>
		<li>Centrifugue a 12.000 x g por 1 h em temperatura ambiente. Assegure a formação do pellet e remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet.</li>
		<li>Ressuspenda o pellet em 1 mL de etanol 75% e centrifugue a 12.000 x g por 1 min em temperatura ambiente. Realize este passo duas vezes e seque o pellet ao ar.</li>
		<li>Ressuspenda o pellet em 50 µL de água livre de nucleases. 
		​NOTA: Para dissolver o RNA, incube-o em água livre de RNase por 10–30 min em temperatura ambiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Método TRIzol
	<ol>
		<li>Adicione 200 µL do reagente TRIzol ao pellet celular. 
		CAUTELA: O TRIzol é uma substância química perigosa; portanto, devem ser seguidos os equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, controles de engenharia como capelas de exaustão e procedimentos específicos de descarte de resíduos.</li>
		<li>Siga o método de lise celular conforme os passos 2.1.2 - 2.1.3.</li>
		<li>Adicione 200 µL adicionais de reagente TRIzol, seguido por 200 µL de clorofórmio, e vortexe por 1 min. Centrifugue a 13.400 x g por 15 min a 4 °C. Assegure a separação adequada de fases após a centrifugação.</li>
		<li>Transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mL.</li>
		<li>Precipite o RNA adicionando 500 µL de isopropanol à fase aquosa e incube a −80 °C por 30 min a 1 h.</li>
		<li>Pelotize o RNA por centrifugação a 15.000 x g por 20 min a 4 °C. Observe cuidadosamente o pellet e remova o sobrenadante sem perturbá-lo.</li>
		<li>Ressuspenda o pellet com 1 mL de etanol 75% e centrifugue a 13.400 x g por 1 min a 4 °C. Repita este passo duas vezes, seque o pellet ao ar por 30 min em temperatura ambiente e ressuspenda em 50 µL de água livre de nucleases.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Método com kit comercialmente disponível para extração de RNA
	<ol>
		<li>Ressuspenda o pellet celular em 200 µL de tampão de ressuspensão (fornecido no kit).</li>
		<li>Siga o método de lise celular conforme os passos 2.1.2 - 2.1.3.</li>
		<li>Realize o experimento subsequente conforme as instruções do fabricante.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Tratamento com DNase, quantificação e visualização
<ol>
	<li>Para remover a contaminação por DNA genômico, adicione 1 µL de DNase I (10 unidades) e 5 µL de tampão RDD (1x) a cada amostra de RNA e incube à temperatura ambiente por 30 min.</li>
	<li>Quantifique a amostra de RNA espectrofotometricamente utilizando o Nanodrop e a integridade do RNA utilizando um Qubit4. O valor aceito de RIN está entre 7,5 e 10. Os valores aceitos de A260/A280 e A260/A230 estão na faixa de 1,8–2,0 e 2,0–2,2, respectivamente.</li>
	<li>Visualize o RNA em gel de agarose a 1% utilizando corante de carga para RNA 1X.</li>
</ol>
4. Síntese de cDNA e PCR quantitativa em tempo real
<ol>
	<li>Prepare uma reação de 20 µL para a preparação de cDNA utilizando o kit de Transcrição Reversa de cDNA e 1 µg de RNA, seguindo as instruções do fabricante em um termociclador.</li>
	<li>Prepare uma reação de PCR em tempo real de 10 µL utilizando 50 ng de cDNA, 0,4 µM de cada par de primers e SYBR de acordo com as instruções do fabricante. Execute a amostra no termociclador de PCR em Tempo Real. 
	OBSERVAÇÃO: Os seguintes primers foram utilizados para análise de qPCR: 
	Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3' 
	Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3' 
	Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3' 
	Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3' 
	Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3' 
	Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'</li>
</ol>
5. Análise estatística
<ol>
	<li>Realize um teste t de Student com todas as réplicas biológicas utilizando o Graph Pad Prism; P ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As barras de erro representam o erro padrão de pelo menos três réplicas biológicas.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+tuberculosis+report%2C+2024%22">Global tuberculosis report, 2024</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/b/74877">https://www.who.int/publications/b/74877</a> (2024).</li>
<li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-resistant+tuberculosis%3A+An+update+on+disease+burden%2C+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment.</a> Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).</li>
<li>Tailleux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+host-pathogen+cross-talk+by+transcriptional+profiling+of+both+Mycobacterium+tuberculosis+and+infected+human+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages.</a> PLoS One. 3 (1), e1403(2008).</li>
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<li>Rustad, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+stability+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).</li>
<li>Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+of+RNA+extraction+from+bacteria+refractory+to+disruption%2C+including+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria.</a> Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).</li>
<li>Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+efficient+method+for+the+isolation+of+DNA-free%2C+pure+and+intact+RNA+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis.</a> J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).</li>
<li>Hiebert, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+extraction+and+RNA-sequencing+method+for+transcriptomic+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis.</a> Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).</li>
<li>Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine-rich+peptides+potently+bind+ESAT6%2C+a+virulence+determinant+of+Mycobacterium+tuberculosis%2C+and+concurrently+affect+the+pathogen%27s+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth.</a> PLoS One. 4, e7615(2009).</li>
<li>Alli, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+RNA+extraction+in+Mycobacterium+tuberculosis+for+studying+intracellular+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Clin+Exp+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression.</a> Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).</li>
</ol>

Não houve conflitos de interesses entre os autores. Todos os autores aprovaram a submissão.

Para desenvolver um método simples e robusto de extração de RNA para Mycobacterium, o método do fenol quente foi otimizado. Posteriormente, o RNA extraído foi comparado com duas abordagens amplamente utilizadas: TRIzol e um método baseado em coluna em kit12,13. Essas técnicas foram comparadas com base no rendimento, pureza, integridade, custo e tempo de processamento do RNA, a fim de avaliar sua praticidade para aplicações moleculares subsequentes. Tanto o método do fenol quente quanto o do TRIzol, embora relativamente demorados em comparação com o método baseado em kit, produziram RNA intacto e de alta qualidade. Os três métodos geraram RNA com pureza e integridade comparáveis; no entanto, o método do fenol quente forneceu consistentemente maior rendimento de RNA. Além disso, o RNA extraído com fenol quente e TRIzol apresentou valores de Ct semelhantes. Contudo, observou-se uma diferença estatisticamente significativa nos valores de Ct entre os métodos do fenol quente e do RNeasy. Como quantidades iguais de RNA foram utilizadas no experimento, esperava-se valores de Ct semelhantes em todos os métodos. As diferenças observadas no caso do método RNeasy podem ser atribuídas a variações na química de extração de RNA. O fenol quente e o TRIzol são métodos baseados em solventes orgânicos e frequentemente mais eficazes na solubilização de transcritos difíceis, como aqueles que codificam proteínas de membrana intrínsecas ou transcritos com alto teor de GC. Em contraste, o RNeasy é um método baseado em coluna de sílica e pode resultar em menor recuperação de certos transcritos que não se ligam eficientemente à membrana ou que são perdidos durante as etapas de lavagem, em comparação com métodos baseados em fenol (Figura 2). Importante ressaltar que rendimentos comparáveis de RNA foram obtidos tanto com um homogeneizador manual de tecidos quanto com um ruptor de perlas para a lise celular, permitindo flexibilidade operacional na realização da lise celular. Além disso, o método de extração foi otimizado para funcionar com pequenos volumes de cultura e sem a necessidade de centrifugação a frio. Essa simplificação aumenta a facilidade e eficiência geral do processamento de amostras.
Um fator importante na seleção de um método de extração de RNA é o equilíbrio entre custo, tempo e qualidade do produto final (Tabela 1). O método do Fenol Quente, apesar de ser um pouco demorado, continua altamente custo-efetivo devido ao uso de reagentes comuns em laboratório e à sua capacidade de produzir altos rendimentos de RNA (RNA de Msmeg: 60–70 µg e RNA de Mtb: 35–45 µg por 3 mL de cultura em fase logarítmica intermediária) mesmo a partir de baixos volumes de cultura, como 3 mL, e sem o uso de equipamentos sofisticados de ruptura por esferas, necessários na maioria dos métodos publicados até o momento. Isso o torna particularmente vantajoso para laboratórios que operam em condições de baixa disponibilidade de recursos. Métodos publicados anteriormente de extração de RNA baseados em fenol quente diferem em vários aspectos essenciais. Por exemplo, Mangan et al. utilizaram M. bovis para extração de RNA pelo método do fenol quente, relatando um rendimento de aproximadamente 20 µg de RNA por 109 células. No entanto, parâmetros críticos, como volume de cultura e temperatura de extração, não foram claramente especificados. Além disso, seu método inclui uma lavagem com detergente usando Divolab-1 antes da ruptura mecânica das células, um reagente que não é facilmente disponível, seguida por extração com clorofórmio e álcool isoamílico11. Em outro método de Fenol Quente, o RNA foi extraído de células de Mtb, obtendo-se aproximadamente 39 µg de RNA total, valor comparável ao método otimizado descrito aqui. Contudo, esse método exigia um volume relativamente alto de cultura (25 mL), aumentando o tempo de processamento e exigindo o uso de centrífugas de maior porte. Além disso, a extração envolve uma mistura de clorofórmio–álcool isoamílico, e a temperatura de extração não é informada12,14. O TRIzol também é amplamente utilizado para obter bom rendimento e qualidade de RNA a um custo moderado15; no entanto, o rendimento foi comparativamente baixo. O kit RNeasy oferece maior praticidade e velocidade, tornando-o adequado para fluxos de trabalho sensíveis ao tempo ou para usuários menos experientes, mas a um custo substancialmente mais alto que os outros dois métodos, além de apresentar rendimento significativamente baixo. Em resumo, o método descrito aqui proporciona flexibilidade operacional na lise de células micobacterianas e na subsequente extração de RNA. Ele permite aos usuários escolher o método mais adequado com base em suas prioridades, seja custo e rendimento ou tempo de processamento, mantendo qualidade e integridade de RNA comparáveis entre os três métodos.

M. tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose (TB), continua sendo a principal causa de morte por um único patógeno infeccioso, superando o HIV/AIDS. Em 2024, a TB foi responsável por aproximadamente 1,3 milhão de mortes em todo o mundo1. Esse ônus é agravado pelo aumento da prevalência de cepas resistentes a múltiplas drogas (RMD) e resistentes a drogas extensivamente (XDR). Portanto, há uma necessidade urgente de compreender a base molecular da patogênese da TB e identificar novos alvos terapêuticos2.
O perfilamento transcricional de Mtb tornou-se uma ferramenta importante para elucidar elementos funcionais envolvidos nas interações hospedeiro-patógeno3, adaptação ao estresse ambiental4 e mecanismos subjacentes à resistência a medicamentos5. Metodologias avançadas, como PCR em tempo real, microarranjos e sequenciamento de RNA (RNA-seq), aumentaram significativamente a capacidade de analisar o transcriptoma micobacteriano6. No entanto, o sucesso desses métodos depende fortemente da disponibilidade de RNA de alta qualidade, o que, por sua vez, depende da lise celular eficiente durante a extração. A parede celular complexa de Mtb, composta por micolil–arabinogalactana–peptidoglicano, torna a extração de RNA particularmente difícil7. Técnicas de lise existentes, incluindo hidrólise enzimática8, sonicação9 e batimento com esferas10, frequentemente exigem equipamentos caros e grandes volumes de cultura, limitando sua praticidade em muitos laboratórios BSL-3. Além disso, a taxa de crescimento lenta de Mtb exige tempos prolongados de cultivo para obter biomassa suficiente11.
Para superar essas limitações, foi desenvolvido um método otimizado de extração de RNA baseado em fenol quente que é rápido e econômico. Utilizando apenas 3 mL de cultura na fase logarítmica média, o método fornece 45–60 µg de RNA de alta qualidade adequado para análises transcritômicas subsequentes. A lise celular é realizada usando um moinho de tecidos compacto e de uso manual, juntamente com reagentes facilmente disponíveis, eliminando a necessidade de instrumentos caros. Embora o método de fenol quente já tenha sido descrito anteriormente11,12, a versão otimizada melhora a praticidade, a relação custo-benefício e o rendimento de RNA. A otimização foi realizada utilizando M. smegmatis mc2155 (Msmeg) e validada com sucesso com Mtb H37Rv.

<table><tbody><tr><td>esferas de sílica de 0,1 mm</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP116911050</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 4&amp;nbsp;</td><td>revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga fria</td><td>ThermoScientific</td><td>42541217</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>sigma</td><td>E02SS</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>SRL</td><td>62889</td><td></td></tr><tr><td>bloco térmico</td><td>MIULAB</td><td>MU-E02-1049</td><td></td></tr><tr><td>kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>moinho de tecidos motorizado G10</td><td>Coron</td><td>G22616008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Nanofotômetro N50&amp;nbsp;</td><td>IMPLEM</td><td>T51601</td><td></td></tr><tr><td>fenol equilibrado com tampão de citrato 0,1 M, pH 4,5</td><td>Sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>fluorímetro Qubit 4&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2.32262E+12</td><td></td></tr><tr><td>ciclador térmico de PCR em tempo real</td><td>Analytik Jena AG</td><td>844-00503-2</td><td></td></tr><tr><td>kit RNA easy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>acetato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>ciclador térmico&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>621BR29739</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRI</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>base de Tris</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>516732</td><td></td></tr></tbody></table>

extração de rna baseada em fenol quente otimizada de micobactérias: uma abordagem robusta para análise confiável de expressão gênica

Optimized Hot Phenol&#8211;Based RNA Extraction from Mycobacteria: A Robust Approach for Reliable Gene Expression Analysis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) continua sendo uma grande ameaça à saúde global, destacando a necessidade de estudos transcriptômicos confiáveis para compreender sua biologia e mecanismos de resistência a medicamentos. Essas análises dependem da obtenção de RNA de alto rendimento e alta qualidade. Embora diversos métodos de extração de RNA estejam disponíveis, muitos exigem reagentes caros, grandes volumes de cultura ou equipamentos especializados, o que limita sua adequação para estudos em larga escala, especialmente em ambientes com recursos limitados. Aqui, apresenta-se um método otimizado de extração de RNA baseado em fenol quente, especificamente adaptado para micobactérias. O método utiliza volume mínimo de cultura e reagentes comumente disponíveis, gerando consistentemente RNA de alta qualidade, adequado para aplicações transcriptômicas de alto rendimento. A quantidade e integridade do RNA foram avaliadas por eletroforese em gel e análise de integridade do RNA (RIN), e sua adequação para aplicações posteriores foi confirmada por qPCR e Qubit 4. Para comparar o desempenho do método otimizado, realizou-se uma extração paralela de RNA utilizando TRIzol e RNeasy em condições experimentais idênticas, incluindo a mesma espécie de Mycobacterium, volume de cultura, fase de crescimento (logarítmica e estacionária) e condições de lise. Isso permitiu uma comparação direta de rendimento, qualidade, viabilidade e custo. O método otimizado de fenol quente demonstrou rendimento e qualidade de RNA comparáveis ou superiores, reduzindo significativamente o custo dos reagentes e a dependência de equipamentos especializados. Devido à sua eficiência, reprodutibilidade e baixo custo, este protocolo oferece uma alternativa prática para estudos em larga escala de expressão gênica e transcriptômica em Mtb e outras espécies de micobactérias.

Qualidade e rendimento do RNA
A qualidade e quantidade de RNA foram avaliadas por eletroforese em gel de agarose (Figura 2). Foram observadas bandas distintas e nítidas correspondentes ao rRNA 23S e 16S para todos os métodos de extração, confirmando o isolamento bem-sucedido de RNA total. Os métodos Hot Phenol e TRIzol apresentaram três bandas claras representando o rRNA 23S (~2900 pb), 16S (~1500 pb) e 5S (~120 pb), indicando RNA intacto e de alta qualidade. Em contraste, o método com kit baseado em coluna mostrou apenas as bandas 23S e 16S, com a banda de rRNA 5S ausente ou abaixo do limite de detecção, provavelmente devido à perda preferencial de RNAs pequenos durante a purificação em coluna. Quantitativamente, o método Hot Phenol obteve um rendimento 1,5 a 2 vezes maior que o TRIzol e o RNeasy, respectivamente (Figura 2A,C). Os rendimentos médios foram de ~60 µg para Hot Phenol, ~45 µg para TRIzol e ~30 µg para RNeasy, sendo este último cerca de 50% menor que o Hot Phenol. Apesar das diferenças no rendimento, a integridade e pureza do RNA foram comparáveis entre os métodos (Figura 2D,E).
Para avaliar a eficiência da abordagem de lise, o RNA também foi extraído utilizando um ruptor de esferas. Rendimentos, qualidade e integridade comparáveis foram obtidos, demonstrando que uma lise eficaz pode ser alcançada usando um moinho de tecidos manual simples, sem depender de equipamentos especializados, como um ruptor/beatedor de esferas (Figura 2B,F–H).
Como o Mtb é mais resistente à lise do que o Msmeg, validamos ainda mais o método Hot Phenol otimizado utilizando a linhagem Mtb H37Rv. A lise celular com o triturador de tecidos e com o ruptor por esferas resultou em RNA com bom rendimento, qualidade e integridade (Figura 3A–D), confirmando a robustez do método. Embora a extração de RNA utilizando um homogeneizador de tecidos manual tenha apresentado um rendimento menor (~35–45 µg/3 mL de cultura) quando comparado ao ruptor por esferas (50–60 µg/3 mL), verificou-se que a diferença não foi estatisticamente significativa, e a quantidade estava dentro da faixa aceitável suficiente para estudos de expressão gênica em larga escala. Todas as extrações de RNA foram repetidas várias vezes, e todas as réplicas biológicas independentes foram apresentadas. Foi realizada análise de densitometria nas imagens dos géis, o que valida ainda mais as diferenças estatísticas no rendimento de RNA entre os diferentes métodos, sendo o método Hot Phenol o que apresentou o maior rendimento (Suplementar Figura 1A–D).
Pureza e integridade do RNA
Todos os métodos produziram RNA com razões A260/A280 aceitáveis em torno de 2,0, indicando contaminação mínima por proteínas (Figura 2D). A integridade do RNA (RIN) foi comparável em todos os métodos, com valores variando de 7,5 a 10 (Figura 2D–H, Suplementar Figura 2, painel inferior). Isso indica boa qualidade, integridade e degradação mínima.
Análise de PCR quantitativa para verificar a qualidade do RNA 
Para avaliar a adequação do RNA extraído por cada método para estudos downstream de expressão gênica, foi realizada qRT-PCR. Estudamos a expressão gênica do gene de manutenção Msmeg, mysA (MSMEG 2758) e dois reguladores transcricionais, sigE (MSMEG 5072) e sigH (MSMEG 1914), utilizando quantidades equivalentes de RNA como ponto de partida. Os valores de Ct (limiar de ciclo) obtidos refletem a abundância relativa de RNA intacto e amplificável em cada amostra. Conforme mostrado em (Figura 2I), o RNA extraído utilizando Fenol Quente e TRIzol apresentou valores de Ct comparáveis na faixa de aproximadamente 22–25, refletindo maior integridade do RNA e compatibilidade com a transcrição reversa e amplificação. Embora o método com kit tenha exibido valores de Ct ligeiramente mais altos (~27–30), indicando níveis mais baixos de transcripto detectável. A análise da curva de dissociação mostrou amplificação específica de mysA, sigE e sigH genes, demonstrando especificidade e eficiência da qPCR (Figura Suplementar 2, painel superior). A análise por qPCR utilizando genes de Mtb também mostrou valores de Ct aceitáveis (~20–25), confirmando a adequação para estudos downstream de expressão gênica (Figura 3E).
<img alt="Comparação da extração de RNA; eletroforese em gel (28S, 18S, 5S) e gráficos de barras de rendimento, Ct e pureza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Comparação de métodos de extração de RNA para Mycobacterium. (AEletroforese em gel de agarose mostrando RNA total extraído pelos métodos Hot Phenol, TRIzol e RNeasy. Bandas distintas de rRNA 23S e 16S são visíveis em todas as amostras, indicando RNA intacto.BEletroforese em gel de agarose mostrando RNA total extraído usando Fenol Quente via diferentes métodos de lise, ou seja, ruptor com esferas e homogeneizador manual de tecidos. (CRendimento total de RNA, mostrando o maior rendimento obtido com o fenol quente, seguido pelo TRIzol e pelo método com kit.DA pureza do RNA foi avaliada pelas razões A260/A280, com todos os métodos gerando valores em torno de ~2,0, indicativos de contaminação mínima por proteínas.E) Número de integridade do RNA (RIN) mostrando integridade comparável. (F–HComparação do rendimento de RNA, razão 260/280 e integridade do RNA entre amostras lisadas por homogeneizador manual de tecidos e por Bead Ruptor, e isoladas utilizando o método de Fenol Quente.I) Valores de Ct de qRT-PCR direcionados a um gene de referência (por exemplo, mysA) e fatores transcricionais (sigE e sigH). As barras de erro representam o erro padrão de três repetições biológicas (n = 3). P-valor calculado utilizando o teste t de Student teste t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig2largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Comparação da extração de RNA de Mycobacterium, eletroforese em gel e gráficos de barras analisando rendimento e pureza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig3.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Isolamento de RNA de Mtb utilizando o método de fenol quente. (A) Eletroforese em gel de agarose mostrando o RNA total extraído utilizando ruptura com esferas e homogeneizador manual com o método de Fenol Quente otimizado, a partir da linhagem Mtb H37Rv. (B–D) Comparação do RNA isolado quanto ao rendimento, razão 260/280 e estimativa da integridade do RNA (RIN). (E) Valores de Ct obtidos por qRT-PCR direcionados aos genes sigA, 16s rRNA e hsp70. As barras de erro representam o erro padrão de três repetições biológicas (n = 3). Valor de p calculado utilizando o teste t de Student. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Fenol Quente</td>
			<td>Trizol</td>
			<td>Kit RNeasy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rendimento</td>
			<td>60 -70 μg</td>
			<td>35 -50 μg</td>
			<td>30 - 45 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempo</td>
			<td>2,5-3 h</td>
			<td>2-2,5 h</td>
			<td>30-45 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custo/reação</td>
			<td>$0,10 – $0,20</td>
			<td>$1,500 – $2,00</td>
			<td>$7,00 – $10,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limitações</td>
			<td>Demorado, uso de desnaturantes fortes (fenol/SDS)</td>
			<td>Demorado, reagentes altamente tóxicos como o Trizol, necessidade de centrífuga fria, 15 vezes mais caro que o método de Fenol Quente</td>
			<td>Custo elevado (72 vezes mais caro que o Fenol Quente), rendimento menor, entupimento da coluna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vantagens</td>
			<td>Rendimento maior a partir de volume menor, baixo custo, não requer batedor para lise celular, não exige centrífuga fria</td>
			<td>Rendimento e custo moderados, necessidade de centrífuga fria</td>
			<td>Rendimento moderado, custo muito elevado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Principais fatores de custo</td>
			<td>Reagentes comuns de laboratório (componentes do tampão TES, fenol ácido, clorofórmio, isopropanol, etanol)</td>
			<td>TRI Reagent® comercial, clorofórmio ou clorofórmio:álcool isoamílico, isopropanol, etanol</td>
			<td>Colunas de centrifugação e tampões proprietários da Qiagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIN</td>
			<td>8-10 RIN</td>
			<td>7,5-10 RIN</td>
			<td>9-10 RIN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Comparação de custo, tempo e limitações entre três diferentes procedimentos de extração de RNA (métodos Hot Phenol, TRIzol e RNeasy).
Figura Suplementar 1: Otimização da extração de RNA. (A) Extração de RNA utilizando Fenol Quente e lise usando um homogeneizador manual de tecidos. (B) Extração de RNA utilizando TRIzol. (C) Extração de RNA utilizando o método RNeasy. (D) Análise densitométrica das imagens de gel da extração de RNA de Msmeg utilizando diferentes métodos. As barras de erro representam o erro padrão calculado usando o GraphPad Prism (n = 8). (E) Extração de RNA utilizando Fenol Quente da linhagem Mtb. Todas as imagens de gel são réplicas biológicas independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/Figure%20S1.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar 2: (Painel superior) Análise da curva de dissociação de mysA, sigE e sigH de M. smeg, n = 3; (Painel inferior) Análise da integridade do RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/Figure%20S2.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este estudo otimiza um método de extração de RNA baseado em fenol quente para Mycobacterium, obtendo RNA de alta qualidade adequado para análises transcriptômicas. Quando comparado com TRIzol e RNeasy em condições idênticas, o método proporcionou maior rendimento, integridade comparável e melhor eficiência de custo, oferecendo uma alternativa prática para estudos de expressão gênica em larga escala.

Extração de RNA Baseada em Fenol Quente Otimizada de Micobactérias: Uma Abordagem Robusta para Análise Confiável de Expressão Gênica

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