Visualizando o Gatekeeper: Avaliação Baseada em Corante Azul de Evan da Permeabilidade da Barreira Hematoencefálica em Peixe-Zebra Adulto

Esta pesquisa se concentra no desenvolvimento de um método confiável, simples e econômico para avaliar a integridade da barreira hematoencefálica em peixes-zebra adultos. A maioria dos estudos com peixes-zebra não tem uma maneira fácil e confiável de medir a ruptura da barreira hematoencefálica, e os métodos existentes costumam ser complexos ou caros. Portanto, este protocolo oferece uma solução prática e acessível.

Este protocolo é simples, econômico e combina análise visual e mensurável, tudo sem a necessidade de equipamentos caros ou etapas complicadas. Ao fornecer um protocolo simples e reprodutível, será mais fácil para os laboratórios explorar as alterações neurovasculares em modelos adultos de doença do peixe-zebra. Para começar, anestesiar o peixe-zebra baixando gradualmente a temperatura da água de 12 graus Celsius para sete graus Celsius até que o peixe não responda mais aos estímulos táteis.

Usando uma seringa de insulina de calibre 31, injete 20 microlitros de azul de Evans a 1%, ou corante EB, na cavidade intraperitoneal do peixe e aplique uma leve pressão no local da injeção por 10 segundos para evitar o refluxo. Agora transfira o peixe para um tanque de recuperação e deixe a recuperação por 30 minutos. Monitore os peixes quanto a lesões, mortalidade ou mudanças comportamentais durante esse período.

Para estabelecer um controle positivo, prepare uma agulha estéril de calibre 31 presa a uma seringa de insulina para realizar um procedimento de ferimento por facada. Após um período de recuperação de 30 minutos, anestesiar novamente o peixe, conforme demonstrado anteriormente. Posicione o peixe na vertical em uma superfície plana e fria, como uma bolsa de gel de gelo.

Insira a agulha em um lado do céfalo em um ângulo de 90 graus a uma profundidade não superior a 1.5 milímetros. Em seguida, transfira o peixe para um tanque de recuperação e deixe-o recuperar por 30 minutos. Depois de sacrificar o peixe por hipotermia, use uma lâmina estéril ou uma tesoura cirúrgica para decapitar o peixe sacrificado.

Enxágue a cabeça duas vezes em 1X PBS usando uma proporção de 1:20 de peixe para PBS para remover o excesso de sangue e corante azul Evans. Em seguida, fixe a cabeça em 4% de paraformaldeído usando uma proporção de 1:20 de peixe para fixador e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Coloque a cabeça fixa em uma placa de Petri limpa e disseque o cérebro usando uma pinça de ponta pontiaguda.

Adicione PBS continuamente gota a gota durante a dissecção para manter o tecido hidratado e evitar o ressecamento. Enxágue o cérebro dissecado duas vezes em dois banhos PBS separados e coloque o tecido em uma placa de agarose a 1% para reter a umidade e evitar o encolhimento. Observe os tecidos cerebrais dissecados sob um microscópio estereoscópico.

Para iniciar a análise quantitativa, baixe e instale o software Fiji e abra o arquivo de imagem cerebral em Fiji. Execute a deconvolução de cores selecionando Imagem, seguida de Cor, Deconvolução de Cores e escolha RGB. Isso resultará em três imagens separadas representando tons de vermelho, verde e azul.

Agora, ative a imagem do canal azul, geralmente rotulada como Cor 3, clicando na imagem. Converta-o em tons de cinza de 8 bits selecionando Imagem, seguido de Tipo e 8 bits. Em seguida, para medir a intensidade de cinza da imagem de 8 bits, defina os parâmetros de medição selecionando Analisar e Definir Medidas.

Em seguida, escolha a área e o valor médio de cinza. Usando a ferramenta de seleção de retângulo, desenhe uma região de interesse de tamanho uniforme e meça a intensidade do cinza selecionando Analisar, seguido de Medir. O peixe-zebra normal exibia um tom de pele acastanhado típico, e o peixe-zebra injetado com EB exibia uma tonalidade azulada perceptível.

Para investigar a integridade da barreira hematoencefálica no modelo parkinsoniano de peixe-zebra adulto, o extravasamento do corante EB nos tecidos cerebrais foi comparado entre o controle injetado com solução salina e o peixe-zebra parkinsoniano. No grupo de controle negativo, os vasos sanguíneos no cérebro pareciam avermelhados, indicando a ausência de extravasamento do corante EB. Em contraste, os grupos controle injetado com solução salina, controle positivo e parkinsoniano mostraram coloração azulada na vasculatura cerebral, confirmando a circulação sistêmica bem-sucedida do corante EB.

Os cérebros dissecados do grupo controle negativo apareceram esbranquiçados com vasos sanguíneos claramente visíveis, confirmando a ausência de coloração EB. No grupo de lesão de controle positivo, a coloração azul intensa ao redor do tecido cerebral indicou vazamento de corante devido à ruptura deliberada da barreira hematoencefálica. No grupo injetado com solução salina, a coloração EB permaneceu confinada aos vasos sanguíneos, indicando uma barreira hematoencefálica intacta.

O grupo parkinsoniano mostrou um padrão de coloração azul mais escuro e difuso, indicando vazamento significativo de corante EB e comprometimento da barreira hematoencefálica. A análise quantitativa da escala de cinza revelou valores de intensidade de cinza significativamente mais baixos no grupo parkinsoniano em comparação com o grupo injetado com solução salina.