Name: Mutagênese precisa de fagos com sistemas CRISPR-Cas assistidos por NgTET (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda mutagênese CRISPR-Cas sem cicatrizes em bacteriófagos usando a enzima NgTET para reduzir modificações de DNA. Este método avança a engenharia de fagos para aplicações em biotecnologia e terapia.

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<ol><li>Pozhydaieva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+epigenome+modulation+enables+efficient+bacteriophage+engineering+and+functional+analysis+of+phage+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications.</a> PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).</li>
<li>Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+as+drivers+of+bacterial+virulence+and+their+potential+for+biotechnological+exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation.</a> FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).</li>
<li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), 205(2018).</li>
<li>Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+omics+reveal+time-resolved+insights+into+T4+phage+infection+of+E.+coli+on+proteome+and+transcriptome+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels.</a> Viruses. 14 (11), 2502(2022).</li>
<li>Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+genome+engineering+for+phage+therapy+to+combat+bacterial+antimicrobial+resistance+as+an+alternative+to+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics.</a> Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).</li>
<li>Vlot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+DNA+glucosylation+impairs+target+DNA+binding+by+type+I+and+II+but+not+by+type+V+CRISPR-Cas+effector+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes.</a> Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).</li>
<li>Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+bacteriophage+T4+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9.</a> ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), aad5147(2016).</li>
<li>Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+evolutionary+analysis+of+eukaryotic+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation.</a> Science. 328 (5980), 916-919 (2010).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Shitrit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+marine+cyanophages+reveals+integration+but+not+lysogeny+in+T7-like+cyanophages%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages.</a> ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).</li>
<li>Dedrick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacteriophages+for+treatment+of+a+patient+with+a+disseminated+drug-resistant+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus.</a> Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).</li>
<li>Marinelli, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRED%3A+a+simple+and+powerful+tool+for+constructing+mutant+and+recombinant+bacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes.</a> PLoS One. 3 (12), e3957(2008).</li>
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<li>Pozhydaieva, N., Höfer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Golden+Gate+assembly+to+streamline+CRISPR-Cas%2FNgTET-based+phage+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis.</a> Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).</li>
<li>Ramírez Rojas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DuBA.Flow%E2%94%80a+low-cost%2C+long-read+amplicon+sequencing+workflow+for+the+validation+of+synthetic+DNA+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs.</a> ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).</li>
<li>Lagerbäck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+T4+endonuclease+II%2C+a+promiscuous+GIY-YIG+nuclease%2C+binds+as+a+tetramer+to+two+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates.</a> Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).</li>
<li>Lagerbäck, P., Carlson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+in+the+GIY-YIG+endonuclease+II+of+phage+T4+affecting+sequence+recognition+and+binding+as+well+as+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis.</a> J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).</li>
<li>Shembrey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+CRISPR-Cas13+mismatch+intolerance+enable+selective+silencing+of+point-mutated+oncogenic+RNA+with+single-base+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision.</a> Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).</li>
<li>Molina Vargas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+design+strategies+for+ultra-specific+CRISPR-Cas13a-based+RNA+detection+with+single-nucleotide+mismatch+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).</li>
<li>Shi, P., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).</li>
<li>Levin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+and+evolutionary+dynamics+of+phage+and+bacteria+with+CRISPR-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).</li>
<li>Hershey, A. D., Chase, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+functions+of+viral+protein+and+nucleic+acid+in+growth+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage.</a> J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).</li>
<li>Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusion+of+glucosyl-hydroxymethylcytosine+DNA+containing+bacteriophages+is+overcome+by+the+injected+protein+inhibitor+IPI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI.</a> J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).</li>
</ol>

Os bacteriófagos são vírus que visam especificamente as bactérias. Eles têm atraído um interesse significativo de pesquisa devido ao seu imenso potencial em biotecnologia e medicina, particularmente na luta contra bactérias multirresistentes 1,2,3. Apesar disso, a biologia dos fagos permanece relativamente pouco estudada. Uma compreensão mais profunda de seus mecanismos moleculares de sequestro de seus hospedeiros bacterianos é essencial para aproveitar plenamente seu potencial terapêutico e biotecnológico4. Para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à infecção eficiente por fagos e ainda mais projetar os fagos para aplicações específicas, a capacidade de modificar geneticamente os genomas dos fagos é essencial. No entanto, continua sendo um dos desafios mais significativos no campo da biologia dos fagos 3,5,6.
O DNA do fago é frequentemente modificado por alterações químicas específicas das bases purina e pirimidina, por exemplo, glicosilação e metilação da citosina. Essas modificações protegem o material genético do fago do reconhecimento e degradação pelas nucleases do hospedeiro6. Embora essas modificações sejam cruciais para a aptidão do fago, elas são um obstáculo significativo para as abordagens de engenharia do genoma do fago que dependem de sistemas de direcionamento de DNA 2,3,7.
As estratégias de mutagênese existentes, incluindo sistemas de modificação de restrição e tecnologias baseadas em proteínas associadas a CRISPR (Cas), enfrentam desafios significativos ao modificar o DNA do fago devido a modificações epigenéticas protetoras, como a glicosilação da citosina8. A edição do genoma mediada por CRISPR-Cas, que é altamente eficaz em células bacterianas e eucarióticas, depende de duas etapas principais: a clivagem precisa do DNA em loci genômicos direcionados pela nuclease Cas, seguida pelo reparo do DNA por meio de recombinação homóloga com o DNA do doador carregando a mutação desejada1. No entanto, em fagos, as modificações no DNA geralmente impedem que as nucleases Cas se liguem ou clivem o genoma de forma eficiente. Além disso, a natureza rápida e transitória da replicação do fago pode limitar ainda mais a eficiência da recombinação homóloga. Essas barreiras tornam particularmente difícil aplicar a tecnologia CRISPR-Cas direcionada ao DNA para mutagênese de fagos. Foi demonstrado que as modificações no DNA do fago prejudicam o direcionamento do DNA do fago com CRISPR-Cas tanto in vitro quanto in vivo 6,7.
Para enfrentar os desafios impostos pelas modificações protetoras do DNA em fagos, introduzimos uma estratégia de mutagênese do genoma que aproveita a atividade da metilcitosina dioxigenase de translocação ten-onze (TET), especificamente NgTET. Em eucariotos, as enzimas TET catalisam a oxidação gradual da citosina metilada por meio de processos iterativos: a metilcitosina (5mdC) é primeiro convertida em hidroximetilcitosina (5hmdC), depois em formilcitosina (5fdC) e, finalmente, em carboxicitosina (5cadC) (Figura 1).
Em nossa abordagem de mutagênese de fagos, o NgTET é usado para reduzir temporariamente a abundância de modificações protetoras do DNA, aumentando assim a acessibilidade do DNA do fago a ferramentas de edição de genoma, como as enzimas Cas9. NgTET, foi selecionado para modular o genoma do bacteriófago devido a relatos anteriores de sua expressão bem-sucedida na forma solúvel ativa em um hospedeiro bacteriano heterólogo, particularmente E. coli. Essa propriedade é essencial, pois o NgTET deve permanecer ativo durante a infecção porfagos 10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69022/69022fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Oxidação gradual da 5-metilcitosina pela TET dioxigenase1. A TET dioxigenase catalisa a oxidação sucessiva de 5-metil-2'-desoxicitidina (5mdC) em 5hmdC, 5-formil-2'-desoxicitidina (5fdC) e, finalmente, em 5-carboxil-2'-desoxicitidina (5cadC). O produto final, 5cadC, reverte espontaneamente ou enzimaticamente para citosina não modificada (dC), contribuindo assim para a regulação epigenética dinâmica. Este processo de várias etapas é central para a metilação ativa do DNA em eucariotos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69022/69022fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Como a metilcitosina e a hidroximetilcitosina são precursores comuns de hipermodificações no DNA do fago, incluindo estruturas protetoras volumosas como glicosilações, a atividade oxidativa da TET dioxigenase pode ser explorada para prevenir a formação dessas hipermodificações de DNA9. Nesta abordagem de mutagênese do genoma baseada em TET, expressamos heterologicamente NgTET recombinantemente em E. coli para oxidar citosinas hidroximetiladas no genoma do fago após a infecção, evitando assim a formação de glicosilação volumosa. Ao diminuir a abundância dessas modificações volumosas do DNA, nossa abordagem pode aumentar a acessibilidade do DNA do fago às nucleases CRISPR-Cas. Essa acessibilidade aprimorada facilita o reconhecimento eficiente do alvo, a clivagem precisa do DNA e a introdução de mutações pontuais sem cicatrizes no genoma do fago, distinguindo-o dos métodos tradicionais de mutagênese de fagos que dependem de deleções de genes, inserções de genes repórteres ou a integração de junções artificiais para seleção de mutantes baseada em PCR 1,11. Essas estratégias convencionais têm sido até agora as únicas ferramentas disponíveis para mutagênese direcionada em genomas de fagos e, portanto, representam uma base importante para o método apresentado aqui. No entanto, proteínas de fago único podem possuir múltiplas funções. A deleção de todo o gene que codifica uma proteína de interesse interrompe todas as funções associadas. Em contraste, a introdução direcionada de mutações pontuais permite a inativação seletiva de funções específicas, permitindo uma análise detalhada de seus papéis. Até o momento, as funções de muitas proteínas de fagos permanecem em grande parte descaracterizadas; assim, podemos ignorar atividades adicionais ligadas a um determinado gene. Portanto, uma abordagem minimalista que visa remover apenas uma única função, causando alterações mínimas na proteína geral, é preferida12,13. O método descrito aqui permite modificações genéticas precisas sem interromper a organização ou função genômica geral. Outro grande desafio dos métodos anteriores de mutagênese de fagos tem sido sua baixa eficiência, que normalmente produzia taxas de mutação de cerca de 0,1%1,11. Com esta técnica, apresentamos a primeira estratégia de mutagênese capaz de introduzir mudanças de códon único, alcançando um notável aumento de sete vezes na eficiência de direcionamento. Ao combiná-lo com um método de triagem de alto rendimento baseado em ONT, a detecção de mutações pontuais é simplificada, eliminando a necessidade de rastrear grandes populações de fagos para isolar um mutante. A estratégia de mutagênese baseada em TET descrita aqui aborda uma limitação de longa data no campo e permite uma edição de genoma mais confiável14.
No geral, esse método não pode ser aplicado apenas para avançar nossa compreensão dos mecanismos de infecção por bacteriófagos, mas também é uma promessa significativa para a biologia sintética. Ao permitir a engenharia precisa e eficiente do genoma do fago, ele abre caminho para adaptar os fagos a aplicações específicas, aumentando assim seu potencial para aplicações biotecnológicas e médicas.

<table><tbody><tr><td>Tubos de reação de 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos canociais de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de parede fina de 15 mL de topo aberto</td><td>Ciências da Vida Beckman Coulter</td><td>361706</td><td>16 mm x 95 mm (para ultracentrifugação)</td></tr><tr><td>Tubos canônicos de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>5x buffer de GC</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>F519L</td><td></td></tr><tr><td>6x TriTrack DNA Loading Dye&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>R1161</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BIOCIÊNCIA MERIDIANA</td><td>BIO-41025</td><td>Grau molecular</td></tr><tr><td>Centrífuga Avanti J-30I</td><td>Ciências da Vida Beckman Coulter</td><td>Sem catálogo&nbsp; número</td><td>Serien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe</td></tr><tr><td>Ácido bórico&nbsp;</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF v2</td><td>NEB</td><td>R3733S</td><td></td></tr><tr><td>Hexahidrato de cloridrato de cálcio</td><td>ACROS ORGÂNICOS</td><td>7774-34-7</td><td>97 %, extra puro</td></tr><tr><td>Medidor de densidade celular</td><td>Biocromo de Harvard&nbsp;</td><td>80211630</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>VWR</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetes</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato dissódico</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>7558-79-4</td><td>Grau farmacêutico</td></tr><tr><td>Pipetas de vidro descartáveis Pasteur</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>230 milímetros</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>10 U/&micro; L</td></tr><tr><td>Mistura dNTP (10 mM cada dNTP)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>DS_SPcas_ModA</td><td>Produto interno.</td><td>https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps</td><td>Construção de plasmídeo que contém CRISPR-Cas12/ModA sgRNA</td></tr><tr><td>DS-spCas (sistema CRISPR-Cas9)</td><td>Adicionar&nbsp;</td><td>48645 (número do acessório addgene)</td><td>Plasmídeo para construção de plasmídeos CRISPR-Cas contendo espaçadores (sistema CRISPR-Cas9) para mutagênese de fagos (etapa 3.2)</td></tr><tr><td>A cepa B de E. coli foi usada para infecção por T4</td><td>DSMZ</td><td>Sem catálogo&nbsp; número</td><td>Escherichia coli (Migula 1895) Castellani e Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) Cepa de expressão, célula competente</td><td>Invitrogen</td><td>C600003</td><td>Cepa de expressão, células competentes.</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alfa; Cepa de clonagem, células competentes</td><td>Invitrogen</td><td>18265017</td><td>Cepa de clonagem, células competentes.&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (absoluto)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>200-578-6</td><td></td></tr><tr><td>Célula de fluxo Flongle</td><td>Tecnologias Oxford Nanopore</td><td>Sem catálogo&nbsp; número</td><td>R10.4.1. Química https://nanoporetech.com/document/flongle</td></tr><tr><td>Kit Miniprep de Plasmídeo Gene JET&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>10242490</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus escada de DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler ULR DNA ladder&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SM1213</td><td></td></tr><tr><td>Mestre Gradiente 108</td><td>BIOCOMP</td><td>Sem catálogo&nbsp; número</td><td>https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming</td></tr><tr><td>Centrífuga Heraeus Pico 17</td><td>Thermo Científico</td><td>75002410</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Infors HT Minitron</td><td>Infors AG</td><td>Sem catálogo&nbsp; número</td><td>https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs</td></tr><tr><td>Isopropil-&beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Canamicina</td><td>Carl Roth</td><td>T832.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-Ágar</td><td>Carl-Roth</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-médio (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl-Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo MinION&nbsp;</td><td>Tecnologias Oxfrod Nanopore</td><td>Sem catálogo&nbsp; número</td><td>https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html</td></tr><tr><td>ModA E165A_fw</td><td>IDT</td><td>GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT</td><td>Cartilha direta para introdução de mutação pontual para ModA E165A e para introdução de extremidades adesivas para clonagem Golden Gate (Etapa 3.1)</td></tr><tr><td>ModA E165A_rev</td><td>IDT</td><td>CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC</td><td>Primer reverso para introdução de mutação pontual para ModA E165A e para introduzir extremidades adesivas para clonagem Golden Gate (Etapa 3.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_fw</td><td>IDT</td><td>TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG</td><td>Primer direto para geração de espaçador para sistemas CRISPR-Cas12 / CRISPR-Cas9 / CRISPR-Cas13 para mutagênese e contra-seleção de fagos (etapa 3.2 e etapa 4.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_rev</td><td>IDT</td><td>AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC</td><td>Primer reverso para geração de espaçador para sistemas CRISPR-Cas12 / CRISPR-Cas9 / CRISPR-Cas13 para mutagênese e contra-seleção de fagos (etapa 3.2 e etapa 4.1)</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop ND-1000</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>AZY2019944</td><td></td></tr><tr><td>Kit NucleoMag</td><td>Machery Nagel</td><td>REFERÊNCIA 744970.50</td><td></td></tr><tr><td>Mistura para digestão de nucleosídeos</td><td>Biolabs da Nova Inglaterra</td><td>M0649S</td><td></td></tr><tr><td>pBA560 (sistema CRISPR-Cas13)</td><td>Addgene</td><td>186236 (número do acessório addgene)</td><td>Sistema CRISPR-Cas13 de codificação de plasmídeo para contra-seleção (etapa 4.1)</td></tr><tr><td>plasmídeo pCpfl-sp (sistema CRISPR-Cas12)</td><td>Addgene</td><td>122186</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo pCpfl-sp (sistema CRISPR-Cas12)</td><td>Addgene</td><td>122186 (número do acessório addgene)</td><td>Plasmídeo para construção de plasmídeos CRISPR-Cas contendo espaçadores (sistema CRISPR-Cas12) para mutagênese de fagos (etapa 3.2)</td></tr><tr><td>Vasos de reação de PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>PeqVERDE</td><td>VWR</td><td>732-3196</td><td></td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>Produto interno.</td><td>Sem catálogo&nbsp; número</td><td>O plasmídeo está disponível mediante solicitação, o mapa do plasmídeo pode ser encontrado no seguinte https://zenodo.org/records/10615143&nbsp;</td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>Produto interno.</td><td>Sem catálogo&nbsp; número</td><td>Plasmídeo para construção de DNA pET28a_NgTET_donor via clonagem Golden Gate (etapa 3.1), plasmídeo&nbsp; estiver disponível mediante solicitação, o mapa de plasmídeo pode ser encontrado no seguinte https://zenodo.org/records/10615143&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td>92 x 16 mm com cames</td></tr><tr><td>DNA polimerase de Phusion&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>F-530XL</td><td>2 U/&micro; L</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>Monobásico</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação universal PowerPac</td><td>Bio Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Kit de Purificação PCR QIAquick&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Fluorômetro Quantus, sistema QuantiFluor dsDNA</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td></td></tr><tr><td>RNase A/T1&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>EN0551</td><td>misture 2 mg/mL de RNase A 5000 U/mL de RNase T1&nbsp;</td></tr><tr><td>Roti-Aqua P/C/I para extração de DNA&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X985.1</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de sequenciamento de ligadura SQK-LSK109</td><td>Tecnologias Oxford Nanopore</td><td>Sem catálogo&nbsp; número</td><td>https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109</td></tr><tr><td>Filtros Steritop, 0,22 &micro; tamanho do poro m</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td>250 mL e 500 mL</td></tr><tr><td>Estreptomicina 50 mg/L</td><td>Carl Roth</td><td>HP66.1</td><td></td></tr><tr><td>Succrose</td><td>NeoFroxx GmbH</td><td>57-50-1</td><td>para biologia molecular&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor de Alumínio de Balde Oscilante</td><td>Ciências da Vida Beckman Coulter</td><td>JS[1]24.15</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase 5 U/&micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de DNA ligase T4</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>B69</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio de parede pesada sem aro</td><td>Karl Hecht GmbH</td><td>42775054</td><td>100 mm x 18 mm</td></tr><tr><td>Termociclador, T100</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Conforto do Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Banho de água, VWB2&nbsp;</td><td>VWR</td><td>462-0557</td><td>12 L de volume</td></tr></tbody></table>

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Precise Phage Mutagenesis with NgTET-Assisted CRISPR-Cas Systems

Identificação da banda do fago no gradiente. A visibilidade da banda do fago no gradiente depende da concentração do fago na amostra inicial carregada no gradiente. Quando o fago está suficientemente concentrado (~ &gt;1 × 1011 PFU / mL), a banda pode ser vista claramente iluminando o gradiente da parte inferior com uma fonte de luz (ver Figura 3).
No entanto, em baixas concentrações de fago, a banda pode não ser facilmente visível. ...

Mutagênese precisa de fagos com sistemas CRISPR-Cas assistidos por NgTET

Bacteriophages, viruses that specifically target their bacterial hosts, hold significant potential for biotechnology and medicine, especially in combating ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

A técnica de genotipagem descrito aqui, que acopla reacção em cadeia da polimerase fluorescente (PCR) para electroforese em gel capilar, permite a genotipagem de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. É contorna as limitações enfrentadas por outras técnicas de genotipagem e é mais rentável do que os métodos de sequenciação.

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

Os avanços recentes na capacidade de manipular geneticamente as linhas celulares somáticas possuem grande potencial para pesquisas básicas e aplicadas. Aqui, apresentamos duas abordagens para CRISPR / Cas9 gerado produção knockout e triagem em linhas de células de mamíferos, com e sem o uso de marcadores selecionáveis.

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de um gene CRISPR/Cas9-baseado edição sistema de reparação de mutações pontuais em células de mamíferos. Aqui, usamos uma abordagem combinatória para gene edição com uma estratégia detalhada de follow-on experimental para medir indel formação no local de destino — em essência, analisando o mutagenesis local.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Utilizando um Cas9 preassembled ribonucleoprotein complexo (RNP) é um método poderoso para edição de genoma preciso e eficiente. Aqui, destacamos a sua utilidade em uma ampla variedade de células e organismos, incluindo células humanas primárias e os dois clássicos e emergentes organismos modelo.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Aqui, apresentamos um método para engenheiro do genoma de c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo dependente de homologia.

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

CRISPR-Cas é uma tecnologia poderosa para projetar os genomas complexos de plantas e animais. Aqui, detalhamos um protocolo eficiente editar o genoma humano usando diferentes endonucleases de Cas. Destacamos importantes considerações e parâmetros de projeto para otimizar a eficiência de edição.

Edição do genoma em linhas de células de mamíferos usando CRISPR-Cas

Aqui, apresentamos um protocolo para otimizar CRISPR-Cas9 para alcançar uma maior especificidade sem perda de atividade no alvo. Usamos uma abordagem de evolução dirigida chamada Sniper-tela para encontrar um mutante Cas9 com as características desejadas. Franco-atirador-Cas9 é compatível com truncado RNAs single-guia e entrega em um formato ribonucleoprotein, conhecidas estratégias para atingir maiores especificidades.

Usando o Sniper-Cas9 para minimizar efeitos fora do alvo de CRISPR-Cas9 sem perda de atividade no alvo através de evolução dirigida

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

O objetivo deste protocolo é permitir a edição perfeita do genoma C. elegans usando complexos de ribonucleoproteína montados e o marcador co-CRISPR dpy-10 para triagem. Este protocolo pode ser usado para fazer uma variedade de modificações genéticas em C. elegans incluindo inserções, exclusões, substituições genéticas e substituições de codon.

CRISPR/Cas9 Edição do Gene C. elegans rbm-3.2 utilizando o marcador de triagem co-CRISPR dpy-10 e complexos de ribonucleoproteína montados.

Este estudo fornece um procedimento sistematicamente otimizado de construção de mutantes homozigotos de gafanhotos baseado em ribonuclease CRISPR/Cas9, bem como um método detalhado para criopreservação e ressuscitação dos ovos de gafanhotos.

Construção de mutantes homozigotos de gafanhotos migratórios utilizando tecnologia CRISPR/Cas9

Uma barreira significativa para tecnologias como o CRISPR são os eventos fora do alvo que podem interromper genes vitais. 'Circularização para relatórios in vitro de efeitos de clivagem por sequenciamento' (CIRCLE-seq) é uma técnica projetada para identificar locais de clivagem não intencionais. Este método mapeia a atividade de todo o genoma do CRISPR-Cas9 com alta sensibilidade e sem viés.

CIRCLE-Seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo

Aprenda mutagênese CRISPR-Cas sem cicatrizes em bacteriófagos usando a enzima NgTET para reduzir modificações de DNA. Este método avança a engenharia de fagos para aplicações em biotecnologia e terapia.

Mutagênese precisa de fagos com sistemas CRISPR-Cas assistidos por NgTET

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