Mutagênese precisa de fagos com sistemas CRISPR-Cas assistidos por NgTET

Estudamos a infecção por fagos em nível molecular. Esta é realmente uma ciência fundamental. No entanto, não estamos apenas fazendo a ciência fundamental, também estamos ansiosos para traduzir essa ciência fundamental em aplicações onde usamos esse conhecimento para estudar a infecção por fagos e usá-lo para engenharia de fagos e para aplicações terapêuticas.

Um dos desenvolvimentos mais recentes no campo da pesquisa de fagos é a descoberta de um sistema imunológico bacteriano. Esse sistema imunológico está presente em todas as bactérias e elas identificaram ou geram ferramentas para realmente lutar contra o fago. No entanto, o fago é bastante inteligente.

Um fago também foi capaz de identificar ferramentas e desenvolver ferramentas que lhe permitem escapar desses sistemas imunológicos. E uma ferramenta é, na verdade, a modificação de seu DNA por modificação. E isso é especialmente para nós, realmente interessante porque estudar a natureza química dessas modificações de DNA que os fagos geraram para escapar do sistema imunológico é realmente interessante e também nos permite nos tornar uma ferramenta para projetar o fago no final.

Nos últimos 10 anos, tecnologias maravilhosas foram desenvolvidas por grandes colegas em todo o mundo. Uma dessas tecnologias é, por exemplo, o sequenciamento de próxima geração. Com base nessa tecnologia, podemos realmente sequenciar o fago, mas também todo o genoma do hospedeiro no nível molecular.

Por outro lado, a espectrometria de massa, algo como proteômica foi desenvolvida. O CRISPR é uma ferramenta maravilhosa que agora é aplicada em vários reinos da vida. E também estamos usando isso agora para projetar o genoma do fago.

Estas são apenas algumas tecnologias maravilhosas que remodelaram a forma como pensamos sobre os fagos hoje. Quando falamos sobre os desafios atuais, um dos desafios que vemos é a engenharia bio CRISPR de um genoma de fago. O genoma do fago é totalmente modificado com modificações no DNA, e os ACEs nucleares CRISPR não são capazes de clivar o DNA.

Portanto, este é realmente um desafio que precisamos superar se quisermos projetar os genomas dos fagos bacterianos. Meu grupo descobriu um bloco de construção totalmente novo de RNAs. Descobrimos que transcritos específicos estão carregando em seus cinco terminais principais, o chamado espectro redox, nicotinamida adenina dinucleotídeo curto NAD, e descobrimos isso também recentemente pela primeira vez em interações de fagos E-coli T4.

Com base nessa descoberta, também identificamos que RNAs e proteínas podem interagir entre si de uma maneira totalmente nova. Descobrimos que esse NAD que descrevi antes está funcionando como uma cola de molécula para ligar RNAs e proteínas entre si. Essa elação de RNA é uma maneira totalmente nova de como RNAs e proteínas interagem uns com os outros na natureza.

E fizemos essa descoberta na interação eco anti fago. Agora também estamos ansiosos para traduzir essa ciência fundamental em aplicações, por exemplo, no campo da terapêutica baseada em RNA. Para começar, trate 500 microlitros de suspensão de fagos com 20 unidades de DNA 1.

Adicione dois microlitros de RNAs AT1 misturados ao tubo. Incube a mistura tratada a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, carregue 500 microlitros da solução de fago tratada em cima de um gradiente de sacarose preparado.

Centrifugar o gradiente a 70 000 g durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Acenda o tubo de centrifugação do fundo para visualizar a banda de fago turva no gradiente. Em seguida, com uma cânula romba, remova cuidadosamente a fração contendo fagos em um novo tubo de ultra ultracentrifugação.

Agora, adicione 30 mililitros de tampão TM gelado ao tubo e centrifugue. Em seguida, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão TM após descartar o sobrenadante. Armazene os fagos ressuspensos em um frasco de vidro a quatro graus Celsius durante a noite.

Adicione um micrograma de proteinase K aos fagos ressuspensos. Incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione um volume igual de mistura de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico à amostra.

Inverta para misturar bem e centrifugue. Transferir a fase aquosa para um novo tubo de reacção e repetir a extracção três vezes. Realize três extrações de clorofórmio usando um volume igual de clorofórmio para remover o fenol residual.

Em seguida, precipite o DNA adicionando 0,1 volume de acetato de sódio de três molares a PH 5,5 e 2,5 volumes de etanol. Incube a mistura durante a noite a menos 20 graus Celsius. No dia seguinte, centrifugue a amostra a 15.000 G por uma hora a quatro graus Celsius para granular o DNA.

Lave o pellet de DNA duas vezes com 200 microlitros de etanol a 70%. Agite suavemente o tubo e centrifugue novamente. Remova cuidadosamente o sobrenadante.

Em seguida, suspenda o DNA purificado em água ultrapura. Armazene o DNA a menos 20 graus Celsius até uso posterior. Inocule células de Escherichia coli BL 21D 3 que são transformadas com o plasmídeo PET 28 NGTet e um plasmídeo de expressão CAS 12 ou CAS 9.

Cultive a cultura em meio LB com suplementado com antibióticos apropriados a 37 graus Celsius com agitação. Induza a expressão de NG TED adicionando IPTG de 0,05 milimolar e incube por mais duas horas a 37 graus Celsius. Como controle, compare cepas de E.coli BL 21 D3 com e sem superexpressão de NgTET.

Transfira 300 microlitros das culturas de E.coli para um tubo estéril. Infecte a cultura com o tipo selvagem T4 ou o fago tratado com NgTET em uma multiplicidade de infecção de 0,01. Misture delicadamente para garantir uma distribuição uniforme do fago e incube novamente.

Adicione a mistura de fagos bacterianos a quatro mililitros de trado macio LB contendo 0,75% de trado e antibióticos. Misture bem, mas delicadamente para evitar a formação de bolhas. Despeje a mistura de broca macia em uma placa de broca LB pré-quente.

Deixe a placa solidificar brevemente à temperatura ambiente e incube durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, conte as placas para determinar o número de unidades formadoras de placas. Para a seleção do contador, infecte o espaçador de 13 A fundido por E.coli usando os fagos a serem selecionados no contra-ataque.

Efectuar a selecção do contador nas mesmas condições utilizadas para a mutagénese. Após a incubação, filtrar o SUP natant através de um filtro de 0,45 micrómetros para remover os detritos bacterianos. Use os fagos selecionados e filtrados para um ensaio de placa em uma cepa de E.coli B para isolar placas individuais para validação a jusante.

A banda do fago foi claramente visível quando a amostra do fago T4 estava suficientemente concentrada. A expressão da proteína NgTET em E.coli foi confirmada pelo fago SDS, mostrando sua presença em frações solúveis e insolúveis após lise celular e centrifugação. Os cromatogramas mostraram que as abundâncias relativas de dioxiadenosina, diiodohidroxiquinolina e timidina permaneceram inalteradas entre o tipo selvagem e o DNA do fago T4 tratado com NgTET.

A abundância de derivados de citosina modificados foi significativamente reduzida no DNA do fago tratado com NgTET em comparação com a amostra não tratada. Um plasmídeo contendo o gene NgTET e regiões de homologia para mutagênese direcionada foi construído usando clonagem golden gate. A triagem por PCR confirmou a amplificação bem-sucedida do gene alvo mare nas pistas dois a nove do gel agros, indicando acertos positivos entre as placas colhidas.

No DNA do fago T4 do tipo selvagem, a abundância relativa de 5 glicosilhidroxietil 2 desoxidina primária foi alta. No DNA do fago T4 tratado com NgTET, os níveis de 5 glicosilhidroxietil 2 prime deoxidine foram fortemente reduzidos em comparação com o tipo selvagem. O DNA do fago T4 tratado com o mutante catalítico inativo NgTET D234 A reteve altos níveis de 5 glicolhidroxietil 2 prime deoxidine.

A progênie de fagos T 4 recuperada mostrou níveis quase restaurados de 5 hidroximetil 2 prime deoxidina em comparação com o tipo selvagem.