Avaliação das Respostas Foliares a Metabólitos Secundários Microbianos Usando um Formato de Alta Produção

Meu laboratório trabalha com interações entre microrganismos de plantas com o objetivo final de melhorar a resistência das culturas de focas usando genética. Desenvolvimentos recentes mostraram que metabólitos secundários microbianos têm um papel fundamental na promoção da suscetibilidade ou resistência às plantas. Para começar, use um furo de cortiça com quatro milímetros de diâmetro para coletar três discos de folha por planta, evitando a veia central.

Com a ponta afiada, aplique um movimento de torção para evitar a maceração do tecido. Adicione metabólitos secundários ou tratamentos com solvente na concentração desejada em poços individuais de uma placa de 96 poços para alcançar um volume final de 200 microlitros. Coloque delicadamente os discos das folhas nos poços.

Coloque a placa de 96 poços com a tampa removida em um pote de sino equipado com um bico a vácuo. Depois, conecte a mangueira de vácuo ao bico do belo e ligue a pressão de vácuo a 9,8 libras por polegada quadrada por 10 segundos. Desligue o vácuo e libere a pressão lentamente ao longo de 10 segundos, e então repita o ciclo do vácuo.

Agora coloque a tampa de volta na placa de 96 poços e incube-a em um shaker orbital sob uma fonte de luz. Posicione 23 centímetros acima do shaker por quatro horas. Lave a sonda em água ultrapura e passe um pouco de lenço sem fiapos para secar.

Note a leitura de condutividade da água para referência futura. Entre quatro e seis horas após o tratamento, meça e registre a condutividade em poços individuais mergulhando a sonda no líquido ao redor do disco da folha. Segure a placa em um ângulo de 45 graus para garantir que a sonda esteja totalmente imersa.

Após a enxaguação, a sonda é demonstrada anteriormente, teste-se ocasionalmente a condutividade da água para confirmar a estabilidade da sonda. Depois, coloque um filme plástico no teto sobre a placa de 96 poços e retorne ao agitador orbital para incubação durante a noite. Para preparar o substrato de peroxidase, aqueça 40 mililitros de água estéril destilada a 70 graus Celsius em um béquer com barra de mistura.

Dissolva 50 miligramas de cinco aminoácidos salicílicos em água aquecida. Depois, adicione mais água para elevar o volume total para 50 mililitros e ajuste o pH para seis usando hidróxido de sódio. Proteja a solução sensível à luz cobrindo o recipiente com papel alumínio.

Em um tubo cônico âmbar de 50 mililitros, prepare uma solução de peróxido de hidrogênio a 1% em água ultrapura. Depois, adicione 10 microlitros da solução de peróxido de hidrogênio a 1% por mililitro de cinco aminoácidos salicílicos necessária para gerar o meio de ensaio. No momento desejado, misture cinco vezes e depois transfira 50 microlitros de cada poço da placa de amostra para uma nova placa.

Adicione 50 microlitros do meio de ensaio e incube em temperatura ambiente por três minutos. Para interromper a reação, adicione 20 microlitros de dois hidróxidos de sódio normais a cada poço e use um leitor de placas para medir a absorvância de cada poço a 595 nanômetros. Água e 0,1% de sulfóxido de dimetil produziram vazamento de íons e níveis de atividade peroxidase semelhantes, validando seu uso como controles negativos.

O tratamento com um micromolar FLG 22 induziu significativamente vazamento iônico, atividade de peroxidase e produção de calosa, confirmando-a como um controle positivo robusto. O tratamento com gramilina induziu vazamento significativo de íons e produção de calosa, mas teve efeitos variáveis sobre a atividade da peroxidase. A surfactina em 10 micromolares induziu tanto a atividade da peroxidase quanto a produção de calosa, enquanto o vazamento iônico permaneceu inalterado.

O tratamento com toxina T-2 suprimiu a atividade da peroxidase, enquanto induzia a produção de calosas e não teve impacto no vazamento de íons. Nosso ensaio hidro permite que os pesquisadores amostrem três respostas diferentes ao estresse na mesma amostra, o que possibilita que os pesquisadores aproveitem ao máximo quantidades limitadas de metabólitos secundários microbianos. A capacidade de comparar 96 amostras na mesma placa permite que pesquisadores façam triagens em nível de genética populacional ou biologia de sistemas para entender as interações entre microrganismos vegetais.

Minha pesquisa continuará focada nas interações entre microrganismos vegetais e na caracterização dos genes das plantas que podemos aproveitar para desenvolver resistência a doenças em culturas de cereais.