Medindo o Envelhecimento de Célula Única com um Biomarcador Baseado em Imagem de Cromatina e Envelhecimento Epigenético

Desenvolvemos cromatina baseada em imagem e imagem epigenética da idade, uma técnica inovadora projetada para quantificar o envelhecimento e o rejuvenescimento em resolução de célula única. Relógios de metilação de DNA estimam a idade biológica, mas dependem da regressão linear, precisam de grandes coortes e destroem amostras, tornando-os caros e inadequados para estudos em larga escala ou longitudinais. Para começar, transfira os órgãos e tecidos congelados para um argamassa pré-resfriado colocado sobre gelo seco.

Despeje nitrogênio líquido sobre o tecido congelado e moa-o cuidadosamente usando um pilão pré-resfriado até obter um pó uniformemente fino. Usando uma espátula metálica pré-resfriada, aliquota o tecido moído em vários tubos. Após extrair os núcleos, misturá-los com azul de tripano em proporção igual em um tubo separado.

Transfira 10 microlitros da mistura para um hemocitômetro ou carregue em um contador automático de células. Insira e verifique todos os metadados, incluindo IDs de amostra, condições e biomarcadores no mapa de placas e exporte um arquivo CSV. Agora, dispense 10.000 núcleos por poço em um volume de 20 a 30 microlitros em uma placa de 384 poços.

Centrifuge a placa a 1000g, com a aceleração ajustada a nove e a desaceleração a quatro, por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, fixe os núcleos adicionando um volume igual de 8% de paraformaldeído e PBS, e incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Após remover o fixador, adicione 30 microlitros de glicina 0,1 molar em PBS e incube por cinco minutos em temperatura ambiente.

Remova a solução de glicina e lave os poços duas vezes com 100 microlitros de PBS. Remova o PBS de cada poço e adicione 30 microlitros de solução bloqueante contendo 2% BSA e 0,5% Triton X-100 em PBS. Incube a placa por uma hora em temperatura ambiente.

Após remover a solução bloqueante, incube a amostra com 25 microlitros de solução primária de anticorpos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave os poços três vezes com 100 microlitros de PBS, cada lavagem durando três minutos em temperatura ambiente. Adicione 25 microlitros de solução secundária de anticorpos e incube por duas horas a quatro graus Celsius.

Depois, lave os poços três vezes com 100 microlitros de PBS, cada lavagem durando três minutos em temperatura ambiente. Tinga os núcleos com DAPI ou Hoechst adicionando 30 microlitros do corante a uma concentração de 0,01 miligrama por mililitro, e lave a placa uma vez com 100 microlitros de PBS para remover o excesso de corante. Baixe os scripts de fluxo de trabalho do repositório do GitHub.

Quando o download estiver concluído, descompacte o arquivo para extrair seu conteúdo. Organize o repositório de imagens clonadas para que a estrutura de pastas corresponda ao formato assumido pelo fluxo de trabalho para a execução correta do script. Depois, abra o aplicativo Terminal se estiver operando no Linux ou Mac OS, ou o aplicativo WSL se estiver usando Windows.

Mude o diretório de trabalho para a pasta do repositório clonado digitando o comando necessário no terminal e pressionando Enter. Crie um novo ambiente computacional chamado Image_workflow usando Conda com Python versão 3.10 e pressione Enter. Ative o ambiente recém-criado Conda com o comando conda activate Image_workflow.

Instale o Poetry, um gerenciador de pacotes Python, dentro do ambiente ativado usando o instalador PIP. Depois, instale todos os pacotes Python pré-requisitos necessários para o fluxo de trabalho usando o Poetry. Agora, configure o CUDA dentro do ambiente Conda para habilitar a funcionalidade da unidade de processamento gráfico durante a etapa de segmentação.

Abra o aplicativo Terminal e mude a pasta para a clonada. Ative o ambiente Conda digitando o comando abaixo e pressionando Enter. Abra o arquivo principal do fluxo de trabalho em um editor de código ou texto, como VS Code ou Notepad, para configurar os parâmetros de análise.

Defina o nome do projeto atribuindo a variável p a um identificador curto de seguro do sistema de arquivos usado para organizar as saídas. Defina a lista de canais para extração de características no chs, incluindo o canal de segmentação se recursos desse canal forem necessários. Usando o ImageIndex e o rótulo do canal como chave, mapeie o identificador de canal da imagem dos nomes dos arquivos para o cabeçalho exato do mapa de placa com sensibilidade a maiúsculas minúsculas salvas anteriormente.

Depois, defina as localizações dos dados atribuindo orgDataLoadPath à rota do conjunto de dados, orgDataSubfolder à subpasta imagem, se necessário, e resultsSavePath à rota de saída. Confirme a extensão do nome do arquivo no imageFileFormat. Depois, edite imageFileRegEx para usar grupos de captura nomeados em Python para as partes necessárias, incluindo linha, coluna, campo, posição Z e canal.

Agora, defina o canal de segmentação em segmentation_ch para o canal nuclear usado para detecção de objetos. Decida se usa correção de iluminação definindo um illumiCorrection e defina como true para calcular e aplicar modelos básicos. Depois, defina o tamanho físico do voxel em micrômetros em voxel_dim como ZYX usando metadados do microscópio.

Salve o arquivo e feche o editor após verificar cada parâmetro. Por fim, execute o script do fluxo de trabalho para obter leituras de imagens e realizar validação, mantendo o terminal aberto enquanto o script está em execução. Visualize resultados e exporte leituras brutas de imagem para análise adicional em software externo.

Imagens representativas de células-tronco pluripotentes induzidas mostraram núcleos claramente separados coloridos com DAPI, histona trimetilada H3 na lisina 27 e histona acetilada H3 na lisina 27. A análise de imagens dos músculos hepáticos e esqueléticos revelou uma diferença significativa entre amostras jovens e idosas, com camundongos OSKM velhos apresentando menor imagem em comparação com os idosos, indicando reprogramação parcial. A análise de animais individuais indicou que algumas amostras antigas de OSKM apresentaram valores de imagem significativamente reduzidos em comparação com camundongos idosos.

Esse protocolo permite que os pesquisadores investiguem mudanças associadas à idade na organização da cromatina e epigenética em uma única resolução celular entre diferentes tipos celulares e diferentes tecidos. Nosso método baseado em imagem é não destrutivo, preserva a estrutura da cromatina, permite medições repetidas e é mais econômico em estudos de grande escala ou longitudinais. Pesquisas futuras focarão em adicionar mais marcadores epigenéticos e estudar estruturas intranucleares relacionadas ao envelhecimento.