Análise específica do subtipo celular do proteassoma da membrana neuronal em neurônios somatossensoriais

Estamos investigando os mecanismos de como os neurônios somatossensoriais se comunicam por meio do proteassoma da membrana neuronal recentemente descoberto ou NNP para modular como sentimos o toque, a coceira e a dor. Recentemente, descobrimos o proteassoma da membrana neuronal, um complexo especializado de degradação de proteínas encontrado em alguns neurônios sensoriais, que funcionam para modular a sensibilidade ao toque, coceira e dor. Com este protocolo, poderemos investigar a dinâmica de expressão e modulação do NMP de maneira específica do tipo celular em condições de saúde e doença.

Nosso protocolo permite o isolamento de neurônios que expressam NMP dos neurônios que não expressam NMP para poder estudar sua função com especificidade de tipo de célula. É importante ressaltar que essas populações neuronais isoladas permanecem viáveis para análises a jusante. Com esses protocolos, começaremos a investigar como diferentes condições neuropáticas afetam a expressão e a função do NMP e como isso contribui para a alteração da sensação de toque, coceira e dor.

Para começar, transfira os gânglios da raiz dorsal colhidos para um tubo cônico de 15 mililitros. Usando uma pipeta, adicione sete mililitros de solução de trabalho de mistura de enzimas de dissociação de tecidos ao tubo e incube a 37 graus Celsius com agitação suave por 20 minutos. Colocar o tubo numa centrifugadora e rodar os gânglios a 120 G durante dois minutos.

Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Ressuspenda os gânglios em sete mililitros de mistura de enzimas de dissociação tecidual de baixa trituração com papaína. Depois de centrifugar novamente o tubo, aspirar e rejeitar o sobrenadante.

Em seguida, ressuspenda os gânglios em 500 microlitros de solução BSA, TI e DMEM. Usando uma pipeta de pastagem de vidro polido com um mililitro, triture os gânglios de 12 a 16 vezes. Passe a suspensão celular por um filtro de célula de 40 micrômetros para filtrar os detritos celulares.

Lave o filtro com um mililitro de solução BSA, TI e DMEM para coletar os neurônios restantes dos gânglios da raiz dorsal. Transferir a suspensão de células filtradas para um tubo cónico de 15 mililitros. Prepare uma bandeja de coloração de imunofluorescência revestindo-a com um grande pedaço de parafilme.

Usando uma pinça estéril de 5 a 45, transfira as lamínulas da placa de cultura de tecidos para o parafilme, garantindo que o lado que contém os neurônios dos gânglios da raiz dorsal esteja voltado para cima. Pipete lentamente 100 microlitros de meios de gânglios da raiz dorsal em cada lamínula para evitar que as células sequem. Em seguida, dilua o anticorpo primário go anti PSM alfa dois em meio quente de gânglios da raiz dorsal para obter uma diluição de um a 20.

Usando um aspirador equipado com uma ponta não filtrada P10, remova lentamente a mídia da borda de cada lamínula. Adicione 100 microlitros da solução de anticorpo anti PSM alfa dois a cada lamínula e incube em temperatura ambiente por 40 minutos. Depois disso, aspire cuidadosamente a solução de anticorpo primário de cada lamínula.

Adicione 100 microlitros de PBS em temperatura ambiente às células e incube em temperatura ambiente por três minutos para lavar. Agora, para preparar o anticorpo anti-go secundário, dilua-o em meios quentes dos gânglios da raiz dorsal em uma diluição de um a 250. Depois de completar a terceira lavagem, adicione 100 microlitros da solução de anticorpo secundário diluído a cada lamínula.

Incube as lamínulas em temperatura ambiente por 40 minutos, protegendo as células da luz. Em seguida, aspire a solução de anticorpos secundários das lamínulas e lave as células três vezes, usando PBS conforme descrito anteriormente. Após a lavagem final do PBS, adicione 100 microlitros de solução fixadora contendo 4% de formaldeído e 4% de sacarose em PBS.

Uma vez que as células são incubadas em temperatura ambiente por 10 minutos, aspire o fixador de cada lamínula. Em seguida, lave as células três vezes com PBS, conforme descrito anteriormente. Para permeabolizar as células, adicione 100 microlitros de detergente não iônico a 0,1% em PBS.

Incube as lamínulas em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, aspirar a solução permeável das lamínulas e lavar as células três vezes, utilizando PBS conforme descrito anteriormente. Adicione 100 microlitros de solução de bloqueio composta por 5% de soro bovino fetal e 5% de soro de burro em PBS a cada lamínula.

Em seguida, dilua o anti CGRP de coelho, o conjugado de biotina A selectina B quatro e o anti NFH de frango na solução de bloqueio para preparar a mistura de anticorpos primários específicos do tipo de célula do neurônio do gânglio da raiz dorsal. Aspire a solução de bloqueio das lamínulas e, em seguida, adicione 100 microlitros da mistura de anticorpos primários preparada a cada lamínula. Incube as lamínulas em temperatura ambiente por 45 minutos, protegendo-as da luz.

Em seguida, remova a solução de anticorpos primários das lamínulas e lave as células três vezes, usando PBS conforme descrito anteriormente. Agora prepare a mistura de anticorpos secundários diluindo estreptavidina, anti-coelho de burro e anti-frango de burro para um a 500 cada em solução de bloqueio. Aspire a lavagem final do PBS de cada lamínula e, em seguida, adicione 100 microlitros da solução de anticorpo secundário preparada.

Incube as lamínulas em temperatura ambiente por 45 minutos no escuro. Aspire a lavagem final da lamínula. Usando uma pinça de ponta fina, levante cada lamínula do parafilme e seque suavemente o excesso de líquido tocando a borda da lamínula em um lenço de papel sem fiapos.

Coloque uma gota de sete microlitros de meio de montagem em uma lâmina de microscópio. Abaixe cuidadosamente a lamínula sobre o suporte de montagem com o lado da célula voltado para baixo, garantindo contato total com o meio. Coloque as lâminas preparadas em uma gaveta ou caixa escura e seca para secar por pelo menos uma hora.

Sele a borda da lamínula com esmalte de secagem rápida e aguarde de 10 a 15 minutos antes de fazer a imagem. O anticorpo que se alimenta de neurônios vivos do gânglio da raiz dorsal revelou uma subpopulação de neurônios com proteassomas acessíveis à superfície, enquanto as amostras de controle sem anticorpo primário não mostraram marcação de superfície. A citometria de fluxo identificou duas populações distintas de neurônios do gânglio da raiz dorsal, com base na intensidade de fluorescência, separando células NMP positivas de NMP negativas com regiões de gating claras estabelecidas, usando controles.

A quantificação das populações classificadas por fluxo mostrou que aproximadamente 4% dos neurônios do gânglio da raiz dorsal eram NMP positivos, enquanto a maioria restante era NMP negativo. Os neurônios NMP positivos e negativos classificados mantiveram a viabilidade e expressaram marcadores específicos do tipo de célula NFH, IB quatro e CGRP, confirmando a adequação do fluxo de trabalho para análise molecular a jusante.