Name: Isolamento de RNA do epitélio da lente ocular de camundongo e massas em massa de células de fibra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprenda a isolar RNA do epitélio da lente ocular e das células de fibra de camundongo usando microdissecção e TRIzol. Este método permite analisar perfis transcriptômicos distintos entre os tipos celulares.

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<ol><li>Lovicu, F. J., Robinson, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLovicu%2C+FJ+%22Development+of+the+Ocular+Lens%22">Development of the Ocular Lens</a>. , Cambridge University Press. (2004).</li>
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<li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+the+Golgi+apparatus+and+the+endoplasmic+reticulum+during+lens+fiber+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The fate of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum during lens fiber cell differentiation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (9), 1793-1803 (1995).</li>
<li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+organelle+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Lens organelle degradation.</a> Exp Eye Res. 74 (1), 1-6 (2002).</li>
<li>Bassnett, S., Beebe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincident+loss+of+mitochondria+and+nuclei+during+lens+fiber+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Coincident loss of mitochondria and nuclei during lens fiber cell differentiation.</a> Dev Dyn. 194 (2), 85-93 (1992).</li>
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<li>60/280 and 260/230 ratios. , Thermo Scientific. 
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<li>Beyer, E. C., Kistler, J., Paul, D. L., Goodenough, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisera+directed+against+connexin43+peptides+react+with+a+43-kd+protein+localized+to+gap+junctions+in+myocardium+and+other+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antisera directed against connexin43 peptides react with a 43-kd protein localized to gap junctions in myocardium and other tissues.</a> J Cell Biol. 108 (2), 595-605 (1989).</li>
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A lente ocular é um órgão transparente que focaliza finamente a luz na retina para produzir uma imagem clara. O cristalino é composto por dois tipos principais de células: uma monocamada de células epiteliais que cobre o hemisfério anterior e células de fibra que compõem a massa maior do tecido (Figura 1). O cristalino é envolvido por uma membrana basal colágena conhecida como cápsula do cristalino, à qual as células epiteliais estão firmemente aderidas. À medida que o cristalino cresce, as células epiteliais no equador proliferam e se diferenciam em conchas nascentes de células de fibra que são colocadas em camadas no cristalino de maneira concêntrica 1,2,3. O crescimento do cristalino ao longo da vida depende da proliferação contínua dessa pequena população de células epiteliais equatoriais que compõem a zona germinativa4. À medida que as células das fibras amadurecem, todas as organelas celulares são degradadas para eliminar objetos de dispersão de luz 5,6,7,8,9,10,11 e manter a transparência do tecido, e as células da fibra mais internas são eventualmente compactadas, resultando em um centro de lente rígido 9,12. Devido à cápsula do cristalino circundante, não há renovação celular no cristalino, e as fibras seminais permanecem no centro do cristalino ao longo da vida, à medida que novas fibras são adicionadas na periferia do tecido ou no córtex. As células de fibra do cristalino têm propriedades ópticas diferentes dependendo de sua idade e podem fornecer um instantâneo temporal das características biológicas variáveis em cada estágio13.
Apesar das opções cirúrgicas disponíveis, a catarata, definida como qualquer opacidade no cristalino normalmente transparente, continua sendo a principal causa de cegueira no mundo14. A catarata pode se manifestar no epitélio, córtex ou núcleo do cristalino com diferentes fisiopatologias15. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares da formação de catarata permanecem obscuros16,17. Para entender melhor como prevenir esses diferentes tipos de catarata e desenvolver alternativas à cirurgia, devemos entender melhor como esses diferentes tipos de células mantêm sua homeostase no cristalino.
As células epiteliais e fibrosas desempenham diferentes papéis fisiológicos no cristalino. A proliferação celular, por exemplo, é restrita ao epitélio do cristalino18. Enquanto isso, as fibras da lente compreendem a massa total da lente, fornecendo estrutura e propriedades de refração à lente9. Para obter uma perspectiva mais sutil dos processos biológicos envolvidos nos diferentes compartimentos do cristalino, as células epiteliais e fibrosas devem ser investigadas separadamente. Aqui, apresentamos um método para isolar o epitélio da massa a granel da célula da fibra, extrair mRNA de cada fração e analisar esses transcritos usando a reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa (RT-qPCR).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69079/69079fig1.jpg"> 
Figura 1: Diagrama de anatomia da lente. O cristalino é composto por dois tipos de células, uma célula epitelial monocamada (azul e laranja) cobrindo o hemisfério anterior e uma massa em massa de fibras do cristalino (brancas). O tecido é circundado por uma fina membrana colágena, conhecida como cápsula do cristalino (bronzeado). As células epiteliais anteriores (azul) são quiescentes, enquanto as células epiteliais equatoriais (laranja) proliferam, diferenciam-se e alongam-se para se tornarem novas camadas de células fibrosas (brancas) na periferia do cristalino. Novas gerações de células de fibra são sobrepostas às gerações anteriores de fibras em conchas concêntricas. As células de fibra do cristalino mais antigas são compactadas no centro do tecido. Esta figura foi modificada de Cheng (2024)38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69079/69079fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Centrífuga e rotor</td><td>Fisher Científico</td><td>14285554PM</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio, grau HPLC</td><td>Alfa Aesar</td><td>22920</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (190 provas)</td><td>Laboratórios Decon</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (à prova de 200)</td><td>BioReagentes Fisher</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pellet Pilão</td><td>Fisher Científico</td><td>12-141-363</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Curvo; Pinças de Estudante #7</td><td>Instrumentos de precisão mundiais</td><td>501981</td><td></td></tr><tr><td>fórceps reto; Dumont #5</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>fórceps reto; Pinças de Estudante #4</td><td>Instrumentos de precisão mundiais</td><td>501978</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes pequenos</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Limpeza de tarefas delicadas</td></tr><tr><td>Aplicador de filme adesivo MicroAmp</td><td>Biossistemas Aplicados</td><td>4333183</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp EnduraPlate Placa de Reação Rápida Rápida de 96 Poços com Código de Barras</td><td>Biossistemas Aplicados</td><td>4483485</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetadores</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 01-671-120</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio, Dissecção</td><td>Carl Zeiss</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td></td></tr><tr><td>Capa adesiva óptica MiniAmp</td><td>Biossistemas Aplicados</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador MiniAmp</td><td>Biossistemas Aplicados</td><td>Rolamento A37834</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice de placas MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>5353000529</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau molecular</td><td>Fisher Científico</td><td>BP28191</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One Microvolume UV-Vis Espectrofotômetro</td><td>Thermo Científico</td><td>ND-UM-W</td><td></td></tr><tr><td>Minibandejas Nunc MicroWell</td><td>Fisher Científico</td><td>12-565-154</td><td>Bandeja de dissecção</td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>VWR</td><td>201007-012</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Científico</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, 1x Dulbecco's</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta, 10 &micro; L Graduado</td><td>EUA Científico</td><td>1161-3700</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta, 1250 &micro; L XL Graduado</td><td>EUA Científico</td><td>1161-1720</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta, 200 &micro; Perfil L Graduado</td><td>EUA Científico</td><td>1163-1700</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR em tempo real QuantStudio 3</td><td>Biossistemas Aplicados</td><td>A28567</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase Reversa, SuperScript IV VILO&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11756050</td><td>Transcriptase reversa altamente processiva e termoestável</td></tr><tr><td>Kit RNA Clean e Concentrador 5</td><td>Zymo</td><td>ZR1013</td><td></td></tr><tr><td>Água sem RNase</td><td>BioReagentes Fisher</td><td>BP2819</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Solução de descontaminação de RNase</td></tr><tr><td>Microcentrífuga SealRite Tubos de 1,5 mL</td><td>EUA Científico</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFine Vannas 8 cm</td><td>Instrumentos de precisão mundiais</td><td>501778</td><td>Tesoura</td></tr><tr><td>TaqMan FAST Advanced Master Mix para qPCR</td><td>Biossistemas Aplicados</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de Ensaio de Expressão Gênica TaqMan (FAM) (MTO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4448892</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Solução de ácido-guanidínio-fenol</td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Thermo Científico</td><td>88880017</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de rna do epitélio da lente ocular de camundongo e massas em massa de células de fibra

RNA Isolation from Mouse Ocular Lens Epithelium and Fiber Cell Bulk Masses

O epitélio e as fibras do cristalino foram isolados de camundongos selvagens de 6 a 7 semanas de idade. Três camundongos foram usados para esses experimentos, e 2 cápsulas de lente ou 2 massas de células de fibra de cada camundongo foram agrupadas para uma réplica biológica. Conforme descrito no protocolo, o RNA foi extraído usando a separação de fases do reagente TRIzol. Em média, um par de epitélio do cristalino e massas a granel de fibra produziram 0,8 μg (DP ± 0,2) e 9,7 μg (DP ± 2,3) de RNA, respectivamente. A conce...

Isolamento de RNA do epitélio da lente ocular de camundongo e massas em massa de células de fibra

The lens is a specialized, transparent tissue in the anterior chamber of the eye that is comprised of two major cell types, epithelial cells and fiber ...

rna-isolation-from-mouse-ocular-lens-epithelium-fiber-cell-bulk

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, descrevemos um protocolo para um laser reprodutíveis captura microdissection (LCM) para isolar a malha trabecular (TM) para a análise de RNA a jusante. A capacidade de analisar as alterações na expressão gênica na TM vai ajudar na compreensão do mecanismo molecular subjacente de doenças oculares relacionadas ao TM.

Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

A glândula lacrimal (LG) tem dois tipos de células expressando α-actínio do músculo liso (αSMA): células mioepiteliais (MECs) e pericytes. Os MECS são de origem ectodérmica, encontrados em muitos tecidos glandulares, enquanto os pericitos são células musculares lisas vasculares de origem endodérmica. Este protocolo isola MECS e pericitos de LGS murino.

Isolamento de células mioepiteliais das glândulas lacrimal e submandibular de Murina adulta

Este protocolo descreve métodos para preparar células de fibras periféricas, maduras e nucleares do cristalino ocular para coloração por imunofluorescência para estudar interdigitações complexas célula-célula e a arquitetura da membrana.

Preparo e Coloração por Imunofluorescência de Feixes e Células Monofibrais do Córtex e Núcleo do Cristalino Ocular

Este manuscrito descreve um protocolo de vídeo detalhado para a cultura de células epiteliais primárias do cristalino (LECs), com o objetivo de melhorar a reprodutibilidade e auxiliar a pesquisa em catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Ele oferece instruções passo a passo sobre dissecção de lentes, isolamento de LECs e validação, servindo como um guia valioso, especialmente para recém-chegados no campo.

Otimizando a cultura de células epiteliais primárias de lente de camundongo: um guia abrangente para tripsinização

Os protocolos descritos são novos métodos de visualização de estruturas periféricas na lente ocular com métodos de quantificação de imagens. Estes protocolos podem ser utilizados em estudos para melhor compreender a relação entre as estruturas da microescala do cristalino e o desenvolvimento/função do cristalino.

Imagens de montagem completa para visualizar e quantificar a estrutura da lente periférica, a morfologia e a organização da célula

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para isolar células gliais de Müller da retina de olhos de camundongos. O protocolo começa com a enucleação e dissecção dos olhos de camundongos, seguida de isolamento, semeadura e cultura de células de Müller.

Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Recentemente, identificamos o enrijecimento capilar da retina como um novo paradigma para a disfunção retiniana associada ao diabetes. Este protocolo elabora as etapas para o isolamento dos capilares retinianos de camundongos e da matriz subendotelial das culturas endoteliais da retina, seguidas de uma descrição da técnica de medição da rigidez usando microscopia de força atômica.

Isolamento de capilares retinianos de camundongos e matriz subendotelial para medição de rigidez usando microscopia de força atômica

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Aqui, apresentamos um protocolo para obter suspensões unicelulares de alta qualidade de córneas inteiras de camundongo por meio da digestão sequencial com colagênase A e tripsina. Esse método gera células únicas viáveis com alta integridade de RNA, tornando-as compatíveis com aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA de célula única e citometradorde fluxo y.

Um Protocolo para Colheita de Suspensão de Célula Única de Córneas de Camundongos

Aprenda a isolar RNA do epitélio da lente ocular e das células de fibra de camundongo usando microdissecção e TRIzol. Este método permite analisar perfis transcriptômicos distintos entre os tipos celulares.

Isolamento de RNA do epitélio da lente ocular de camundongo e massas em massa de células de fibra

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