Name: Geração de organoides de pele planar com pêlos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Aprenda a gerar organoides de pele com folículos capilares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando cultura em interface ar-líquido. Este método recapitula a arquitetura da pele humana para estudo de doenças.

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<ol><li>Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dermatol+Nurses+Assoc%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the skin.</a> J Dermatol Nurses Assoc. 3 (4), 203-213 (2011).</li>
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<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 Avançado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#12634010</td><td>referido como meio avançado no texto.</td></tr><tr><td>ALK5, inibidor. TGFb tipo 1, SB431542</td><td>Tocris Biociências</td><td>#1614</td><td>Aliquot, armazene em -20 & deg; C e &nbsp; mantenha a 4 graus; C por um máximo de 7 dias &nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo anticlonal monoclonal de rato Anti-CD104 439-9B</td><td>BD em Biociências</td><td>#555719</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal anticolágeno tipo IV</td><td>MerckMillipore</td><td>#Ab769</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal do coelho anti-citoqueratina 10</td><td>Biolenda</td><td>#905401</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal do coelho anti-loricirina</td><td>Biolenda</td><td>#905101</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de camundongos anti-PMEL</td><td>Novus Biologicals</td><td>#NBP2-29407&nbsp;</td><td>NA</td></tr><tr><td>Suplemento de B-27, Menos Vitamina A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#12587010</td><td>Aliquot, armazene em -20 & deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Inserções de cultura celular</td><td>Greiner Bio-one</td><td>#665641</td><td>12-poços, tamanho dos poros 0,4 & micro; m; transparente (48 inserts/caixa); https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html</td></tr><tr><td>Colágeno Tipo I</td><td>Corning</td><td>#354249</td><td>Mantenha a solução original em 4 graus; C</td></tr><tr><td>Bisturi descartável estéril 0507 Nº 21</td><td>Swann Morton</td><td>#0507</td><td>NA</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soro Tamponado com Fosfato (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#14190094</td><td>NA</td></tr><tr><td>Essencial 6 (E6) médio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A1516401</td><td>referido como meio mínimo hiPSC (hiMinM) e nbsp; no texto.</td></tr><tr><td>Fasudil</td><td>LC Labs</td><td>#F-4660</td><td>Aliquota uma solução 1000x de estoque e armazene a -20 °C. Depois de descongelar, mantenha a 4 graus; C por um máximo de 14 dias &nbsp;</td></tr><tr><td>Dissociação de Células Suaves&nbsp; Reagente</td><td>Tecnologias Stemcell</td><td>#100-0485</td><td>NA</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#35050038</td><td>NA</td></tr><tr><td>Grau básico de prenium FGF-2 humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>#130-093-842</td><td>Aliquot, armazene em -80 °C; C e &nbsp; mantenha a 4 graus; C por um máximo de 7 dias &nbsp;</td></tr><tr><td>LDN 193189 diidrocloreto</td><td>Tocris</td><td>#6053</td><td>Aliquot, sensível à luz, armazene a -20 & deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Fator de crescimento Matrigel reduzida matriz de membrana basal</td><td>Corning</td><td>#354230</td><td>Aliquot, armazene em -20 & deg; C e &nbsp; mantenha a 4 graus; C por um máximo de 7 dias &nbsp;</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21985023</td><td>Substância perigosa, tóxica, corrosiva, irritante, risco à saúde e ambiental.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>#567530-250MG</td><td>Substância perigosa, corrosiva e irritante. Prepare uma solução de forma espontânea.</td></tr><tr><td>Meio Neurobasal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21103049</td><td>referido como meio basal neural &nbsp; no texto.</td></tr><tr><td>Normocin 50 mg/ml</td><td>Invivogen</td><td>#ant-nr-1</td><td>referido como suplemento antibiótico-antimicoótico, no teste. Aliquot, armazene em -20 & deg; C e &nbsp; mantenha a 4 graus; C por um máximo de 14 dias &nbsp;</td></tr><tr><td>Microplaca Nunclon Sphera 96-Poço de Fundo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#174929</td><td>NA</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 174930 multidício de 24 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#174930</td><td>NA</td></tr><tr><td>Suplemento N2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#17502048</td><td>Aliquot, armazene em -20 & deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#88881102</td><td>NA</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15070063</td><td>NA</td></tr><tr><td>Proteína recombinante humana BMP4</td><td>R& Sistemas D</td><td>#314-BP-010</td><td>Aliquot, armazene em -80 °C; C e &nbsp; mantenha a 4 graus; C por um máximo de 7 dias &nbsp;</td></tr><tr><td>StemFlex (SF) médio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A3349401</td><td>referido como meio de manutenção hiPSC (hiMM) e nbsp; no texto.</td></tr><tr><td>SteriMax smart&nbsp;- Esterilizador de Loop Infravermelho</td><td>WLD-TEC</td><td>#4.002.000&nbsp;</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Merck</td><td>#T4537-1EA</td><td>Estilo 5; Aço inoxidável fino, afiado como agulha e antimagnético</td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Tecnologias Stemcell</td><td>#07180</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

geração de organoides de pele planar com pêlos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Planar Hair-bearing Skin Organoids Using an Air-Liquid Interface Culture System

A otimização e os pontos de verificação para a geração de SOs císticos foram amplamente descritos14. O método apresentado aqui, portanto, concentra-se nos principais pontos de verificação a serem avaliados durante o desenvolvimento de organoides císticos (Figura 2A), na seleção daqueles adequados para a transição para SOs planares (Figura 2B) e nos critérios usados para avaliar a qualidade dos SOs planares resultantes (Figura 1B-D e Figura 4).
O primeiro passo fundamental no desenvolvimento de SOs císticos é a formação de um agregado celular único e denso que incorpora a maioria das células presentes no poço no Dia 0 (Figura 2A). Isso é conseguido por meio do manuseio cuidadoso e rápido de hiPSCs, combinado com centrifugação eficiente, resultando em uma distribuição homogênea de células no centro do poço (Figura 2A, Dia -2). A indução adequada do ectoderma de superfície leva à formação de um epitélio fino e claro na camada mais externa do agregado no Dia 3 (Figura 2A), que subsequentemente se desenvolve, após a indução de células mesenquimais, em agregados císticos transparentes contendo um núcleo escuro de células mesenquimais no Dia 8. Entre os dias 12 e 20, o cisto epitelial fica coberto por uma fina camada de células mesenquimais que se acumulam em um pólo do cisto (Figura 2A, Dia 12). A co-indução bem-sucedida de células epiteliais e mesenquimais resulta em um epitélio estratificado, permitindo a formação de placódios e pinos capilares, que se tornam visíveis entre os dias 50 e 80 (Figura 2A, B). Ao selecionar SOs apropriados com base nesses pontos de verificação de desenvolvimento, a variabilidade morfológica e de tamanho pode ser minimizada no momento da transição para SOs planares.
A presença de placódios ou pinos de cabelo é o principal critério de inclusão para a seleção de SOs císticos para posterior desenvolvimento em SOs planares. A ausência de placódios visíveis geralmente resulta de um defeito na estratificação epidérmica, que então parece extremamente fina (Figura 2B, Dia 50, painel do meio). Para o achatamento, são utilizados apenas cistos grandes (pelo menos 5 mm de diâmetro) com subprodutos concentrados em um polo e subprodutos mínimos gerais, enquanto aqueles com subprodutos não polarizados são excluídos (Figura 2B).
Uma vez em sua configuração planar, a verificação primária da qualidade dos SOs depende do monitoramento macroscópico do crescimento de HF sob um estereomicroscópio. Os HFs se alongam progressivamente ao longo dos 27 dias de cultura de LPA, com as glândulas sebáceas tornando-se visíveis por volta do dia 14 e a pigmentação aumentando gradualmente ao longo do tempo (Figura 1B, C). Devido às restrições espaciais impostas pela membrana de inserção logo abaixo do fino gel de colágeno, apenas os HFs localizados na periferia do SO planar podem crescer totalmente, e o fazem em uma orientação paralela à inserção ( Figura 1C ). Notavelmente, a haste do cabelo raramente se projeta além da superfície da pele. Para avaliar melhor a qualidade dos SOs planares desenvolvidos, eles podem ser incluídos em parafina ou OCT, seccionados e corados para examinar sua composição e morfologia. A coloração H&amp;E revela que sua estrutura se assemelha muito à da pele humana (Figura 4A), com um epitélio totalmente estratificado e uma derme separada por uma membrana basal. A coloração por imunofluorescência usando marcadores específicos para as diferentes camadas epidérmicas, glândulas sebáceas e melanócitos confirma ainda mais a arquitetura do tecido semelhante à pele humana dos SOs planares (Figura 1D e Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig1.jpg"> 
Figura 1: Fluxo de trabalho para gerar SOs planares contendo HFs de hiPSCs usando um sistema de cultura ALI. A representação esquemática e as imagens representativas das principais etapas são mostradas. (A) Geração de SOs císticos, essencialmente como descrito anteriormente10, até que placódios / pinos de cabelo visíveis se formem por volta do dia 80. (B) Os SOs císticos são incisados e achatados, com o lado da epiderme voltado para cima, em uma inserção de cultura de células revestida de colágeno tipo I. As culturas de LPA são mantidas por 21 dias em condições umidificadas, seguidas de 6 dias em condições secas. (C) Vista de alta ampliação de uma região mostrada em (B), ilustrando o crescimento do folículo piloso, desenvolvimento da estrutura semelhante à glândula sebácea (pontas de setas) e pigmentação progressiva ao longo do tempo. (D) Imagens confocais de seções planares de SO no dia 27 após o achatamento, marcadas com anticorpo anti-colágeno tipo IV junto com vermelho do Nilo, que marca estruturas semelhantes a glândulas sebáceas, ou anticorpo anti-PMEL, que cora os melanócitos. Os núcleos são contracorados com DAPI. Barras de escala: 200 μm (A); 500 μm (B,C); 50 μm (D). Abreviaturas: SOs = organoides da pele; HFs = folículos pilosos; hiPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas por humanos; ALI = interface ar-líquido; Col IV = colágeno tipo IV; PMEL = proteína pré-melassoma; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig2.jpg"> 
Figura 2: Imagens representativas da morfologia do agregado celular nas principais etapas durante a produção de SO. (A) Imagens representativas de SOs císticos com morfologias apropriadas (painéis esquerdo) e inadequadas (painéis médio e direito) em diferentes estágios. No Dia -2, os agregados celulares devem apresentar uma distribuição uniforme (painel esquerdo), enquanto o manuseio inadequado da placa após a centrifugação pode interromper a distribuição celular (painel direito). No Dia 0, agregados bem formados aparecem como aglomerados celulares compactos e densos (painel esquerdo), enquanto a baixa viabilidade celular resulta em morte celular generalizada e perda das estruturas 3D compactas (painel direito). No dia 3, uma camada epitelial externa distinta torna-se visível (painel esquerdo), sua ausência pode indicar que a concentração de BMP4 precisa de otimização (painel direito). No dia 12, as células mesenquimais se acumulam em um pólo e migram para envolver o cisto epitelial (painel esquerdo), enquanto a diferenciação epitelial excessiva (painel do meio) ou mesenquimal (painel direito) impede a estratificação epitelial adequada. No dia 50, os SOs exibem morfologia bipolar, com pele cística de um lado e subprodutos, predominantemente cartilagem, do outro (painel esquerdo). A diferenciação epitelial excessiva (painel médio) ou mesenquimal (painel direito) dificulta o desenvolvimento adequado da pele. (B) Imagens representativas de SOs císticos com grampos de cabelo visíveis por volta do dia 80. Observe a proporção variável de subprodutos (à esquerda para a curva tracejada) em relação à pele. Os três painéis mais à esquerda permitem a geração de 2-4 SOs planares, enquanto o painel mais à direita mostra um SO de qualidade insuficiente para achatamento. Barras de escala: 500 μm para o Dia -2, Dia 50 e Dia 80; 200 μm para o dia 0, dia 3 e dia 12. Abreviatura: SO = organoide da pele. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig3.jpg"> 
Figura 3: Representação esquemática das etapas técnicas para a produção de SOs planares. Realize o achatamento de SOs císticos sob um estereomicroscópio dentro de um capuz LAF. (A) Extirpar o poste que acumula subprodutos do SO cístico usando um bisturi estéril. (B) Apare as extremidades superior e inferior do SO para facilitar o desdobramento do tecido. (C) Corte o tecido planar em 2-4 pedaços. Transfira e alise cada peça, com o lado epidérmico para cima, em uma inserção revestida de colágeno usando uma pinça estéril. (D) Coloque o inserto de cultura contendo o tecido achatado em uma placa padrão de 12 poços contendo 600 μL de meio. (E) Incubar a placa a 37 °C com 5% de CO2. (F) Vista transversal esquemática do organoide da pele representado em (B). (G) Vista transversal esquemática do organoide da pele representado em (C). (H) Imagem de um SO planar colocado em um gel de colágeno tipo I derramado em um inserto de cultura de células posicionado em uma placa de 12 poços contendo 600 μL de meio. Abreviaturas: SO = organoide da pele; LAF = fluxo de ar laminar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig4.jpg"> 
Figura 4: Caracterização de SOs planares derivados de hiPSC. (A) Imagens representativas de campo claro de SO planar corado com H &amp; E nos dias 1 e 27 após o achatamento. No dia 27, os SOs planares mostram maturação da pele com epiderme pluriestratificada e HFs contendo estruturas semelhantes a glândulas sebáceas (pontas de setas). (B) Imagens confocais de seções planares de SO coradas com integrina anti-β4 e anticorpos anti-queratina 10 ou anti-loricrina mostram diferenciação suprabasal precoce (células KRT10+ ) no Dia 1 e diferenciação tardia (camada LOR+ ) no Dia 27. Os núcleos são contracorados com DAPI. Barras de escala: 50 μm (A); 100 μm (B). Abreviaturas: SO = organoide da pele; hiPSC = célula-tronco pluripotente induzida por humanos; H&amp;E = hematoxilina e eosina; β4 = integrina b4; KRT10 = queratina 10; LOR = loricrina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Geração de organoides de pele planar com pêlos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived skin organoids (SOs) containing hair follicles provide a sophisticated in vitro model for ...

generation-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-planar-hair

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Geração de reconstruções organotípicas de pele completa: um procedimento para estabelecer um modelo de pele 3D usando amostras de pele humana

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As iPSCs humanas são induzidas a formar corpos embrióides (EBs). Os EBs são cultivados sobre um andaime de polímero usando um meio de indução, promovendo a diferenciação em células-tronco neurais, células progenitoras e neurônios imaturos. Finalmente, os EBs são embutidos em uma matriz e transferidos para um meio de manutenção para a formação de organoides cerebrais.

Geração de Organoides Cerebrais Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Este manuscrito fornece um procedimento passo a passo para a derivação e manutenção de queratinócitos humanos a partir de cabelos arrancados e subsequente geração de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de integração (hiPSCs) por vetores epissómicos.

Geração de Integração Induced-livre Human células estaminais pluripotentes usando o cabelo derivado queratinócitos

Propomos um protocolo que mostra como diferenciar pluripotentes induzidas células-tronco derivadas de queratinócitos e fibroblastos e gerar uma pele 3D organoides, usando estes queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo contém uma etapa adicional de gerar um modelo de ratos humanizados. A técnica aqui apresentada vai melhorar pesquisa dermatológica.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

Este protocolo permite a diferenciação de células pluripotentes humanas em organoides intestinais. O protocolo mimetiza o desenvolvimento humano normal, diferenciando as células em uma população de endoderme definitivo, endoderme do intestino posterior e, em seguida, epitélio intestinal. Isso torna o protocolo adequado para estudar tanto o desenvolvimento intestinal quanto aplicações de modelagem de doenças.

Geração de organoides intestinais derivados de hiPSC para aplicações de modelagem de doenças e desenvolvimento

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Para obter organoides cerebrais em grandes quantidades e de alta qualidade, usamos mini bioreatores caseiros.

Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

O presente protocolo descreve células pluripotentes pluripotentes induzidas por células-tronco derivadas do tipo 2 (iAT2s). Essas células podem ser cultivadas como esferas de auto-renovação na cultura 3D ou adaptadas à cultura de interface ar-líquido (ALI).

Gerando esferas 3D e culturas de interface ar-líquido 2D de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem

Os recentes avanços nos protocolos de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidos pelo homem permitem a derivação stepwise de tipos celulares específicos de órgãos. Aqui, fornecemos etapas detalhadas para a manutenção e expansão das células basais derivadas das vias aéreas derivadas do iPSC e sua diferenciação em um epitélio mucociliary em culturas de interface ar-líquido.

Geração de culturas de interface ar-líquido de células epiteliais das vias aéreas a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Este protocolo descreve a geração de vasos sanguíneos auto-organizadores a partir de células-tronco pluripotentes e pluripotentes induzidas humanas. Essas redes vasculares exibem uma extensa e conectada rede endotelial circundada por pericitos, actina de músculo liso e membrana basal contínua.

Geração de Organoides de Vasos Sanguíneos Humanos a partir de Células-Tronco Pluripotentes

Este protocolo apresenta um método para geração de organoides vasculares utilizando células-tronco pluripotentes humanas.

Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Aprenda a gerar organoides de pele com folículos capilares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando cultura em interface ar-líquido. Este método recapitula a arquitetura da pele humana para estudo de doenças.

Geração de organoides de pele planar com pêlos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de organoides de pele planar com pêlos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido

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