Geração de organoides de pele planar com pêlos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido

O escopo da minha pesquisa é tentar desenvolver um modelo de dano induzido por UVB para que eu possa estudar a patogenicidade de uma doença rara, xeroderma pigmentosa, ou mais precisamente, XPA. Um dos desafios desses modelos in vitro é que leva bastante tempo para ser cultivado, aproximadamente quatro meses, e como ainda é um campo relativamente jovem, ainda precisamos caracterizá-los um pouco melhor. As vantagens desse modelo, como o modelo 3D derivado do hiPSC, a cultura de que a interface ar-líquido recapitula a arquitetura da pele humana e possui um apêndice cutâneo como glândula sebácea e folículos capilares.

Para começar, prepare uma solução de um molar adicionando pellets de hidróxido de sódio a um tubo vazio de 15 mililitros. Adicione água destilada aos pellets e faça um vórtice no tubo para dissolver os pellets. Esterilize a solução de hidróxido de sódio de 0,1 molar usando um filtro de membrana do tamanho de poro de 0,2 micrômetro.

No gelo, dilua a solução de colágeno tipo I com 10 vezes PBS, hidróxido de sódio de cinco milimolares e água destilada para ajustar o volume final. Distribua 150 microlitros dessa solução de colágeno em cada inserção, colocando em uma placa padrão de 12 poços. Incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos para permitir que o gel de colágeno polimerize.

Em seguida, corte pontas P1000 com um bisturi aquecido para criar pontas de grande calibre. Depois, use as pontas largas dos orifícios para colocar uma estrutura cística selecionada com uma pequena quantidade de médio sobre a tampa de uma placa de Petri de 10 centímetros. Retire cuidadosamente quaisquer subprodutos da estrutura usando um bisturi estéril, enquanto o estabiliza com pinças estéreis do lado oposto.

Extire aproximadamente um milímetro de ambas as extremidades de um organoide cístico da pele adjacente à primeira incisão usando um bisturi. Usando pinças estériles, desdobre suavemente a camada superior da pele. Corte o papel em duas a quatro partes, dependendo do tamanho.

Depois, usando uma pinça estéril, mova cada pedaço sobre um inserto revestido de colágeno com a epiderme voltada para cima. Adicione 600 microlitros de OMM a cada poço de uma placa padrão de 12 poços. Transfira o insert de volta para a placa de 12 poços contendo o OMM.

Depois, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Um único agregado celular denso, incorporando a maioria das células, foi formado até o dia zero por meio de manuseio cuidadoso e centrifugação. A indução adequada da epidermia superficial levou à formação de um epitélio fino e claro na camada externa do agregado até o terceiro dia. No 12º dia, uma fina camada de células mesenquimatosas havia se acumulado em um polo do cisto.

Placodas e pinos capilares tornaram-se visíveis entre os dias 50 e 80, após a coindução epitelial e mesenquimatosa. Organoides sem placodas visíveis apresentavam epitélio extremamente fino e eram excluídos da transição planar. Apenas cistos com pelo menos cinco milímetros de diâmetro e subprodutos polarizados foram selecionados para geração de organoides planos da pele.

Os folículos capilares se alongaram progressivamente ao longo dos 27 dias de cultura da interface ar-líquido. Glândulas sebáceas tornaram-se visíveis por volta do dia 14 na configuração planar. A pigmentação aumentou gradualmente nos organoides ao longo do tempo.

A coloração por hematoxilina e eosina revelou um epitélio estratificado e uma membrana basal que o separa da derme. A coloração por imunofluorescência confirmou a arquitetura semelhante à pele humana em organoides planares da pele.