In Vitro Diferenciação de Células T CD8 de Memória Residente usando Sistema de Co-cultura Organoide-Célula T Epitelial

Nossa pesquisa investiga células T da memória residente CD8 no trato reprodutivo feminino, examinando como infecções e doenças influenciam sua residência, função, manutenção e potencial terapêutico. Métodos existentes limitam a sobrevivência e a estabilidade fenotípica das células T de memória residentes. Esse protocolo possibilita um estudo in vitro escalável ao induzir a residência tecidular por meio da cultura de culto organoide de células T.

Para começar, placar organoides epiteliais vaginais ou VEOs a uma densidade de 10.000 células em 20 microlitros de extrato de membrana basal por poço de uma placa de 24 poços. Coloque a placa na incubadora e mantenha as culturas por sete a dez dias a 37 graus Celsius. Um dia antes da co-cultura, aspire o meio de cultura celular dos poços designados e lave os poços com DPBS.

Aspire o DPBS e depois dispense 600 microlitros de EDTA pré-aquecido de tripsina 0,25% no poço. Utilizando uma pipeta P1000 revestida com BSA, resuspenda completamente para desestabilizar mecanicamente o extrato da membrana do embasamento e transfira o conteúdo do poço para um tubo cônico estéril de 15 mililitros revestido com BSA. Agora coloque o tubo cônico em um banho-maria a 37 graus Celsius.

Após cinco minutos, adicione 10 mililitros de 10% de FBS em RPMI para apagar a tripsinização. Depois, coloque o tubo na centrífuga e gire a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Usando uma ponta de pipeta revestida com BSA, ressuspenda o pellet em 100 a 300 microlitros de meio de cultura organoide de células T ou DMEMF 12 simples.

Conte as células usando um hemocitômetro. Calcule o volume de vírus necessário para alcançar uma multiplicidade de infecção de 0,1 usando o número total de células e o título viral conhecido. Aspire o meio de cultura celular dos poços VEO selecionados para infecção.

Lave cada poço com 500 microlitros de DPBS pré-aquecido e coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após cinco minutos, descarte o DPBS. Adicione 500 microlitros de meio organoide contendo partículas virais suficientes para alcançar uma multiplicidade de infecção de 0,1.

Coloque o prato em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora, girando suavemente o prato manualmente a cada 20 a 30 minutos. Transfira a quantidade adequada de extrato da membrana do basamento necessária para o revestimento de armazenamento de menos 80 graus Celsius para quatro graus Celsius e deixe descongelar por oito horas. Verifique os VEOs sob um microscópio óptico para avaliar o tamanho e a saúde geral.

Confirme que os VEOs têm aproximadamente 100 micrômetros de diâmetro, com morfologia redonda uniforme e mínimas células individuais. Aspire o meio de cultura celular dos poços VEO e lave cada poço com 500 microlitros de DPBS frio e estéril, mantido entre dois e oito graus Celsius. Após remover o DPBS, adicione de 200 a 500 microlitros de solução fria de organoide em cada poço, garantindo pelo menos um volume 10X em relação à gota de extrato da membrana do basamento.

Depois, usando uma pipeta P200 revestida com BSA, desregule mecanicamente o extrato da membrana do embasamento. Agora coloque a placa em um agitador orbital ajustado para aproximadamente 100 rotações por minuto a quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, utilize uma ponta de pipeta revestida com BSA para misturar e transferir o conteúdo de cada poço para um tubo cônico estéril de 15 mililitros revestido com BSA.

Coloque o tubo na centrífuga e gire a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois, descarte o sobrenadante. Lave o pellet VEO com cinco a dez mililitros de DPBS frio e centrifuge-o novamente a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Aspire o DPBS, depois, usando uma ponta de pipeta P1000, ressuspenda o pellet em um mililitro de meio de cultura organoide de células T e coloque a suspensão VEO no gelo até que as células T estejam prontas para co-cultura. Para coletar células T, verifique as células T em repouso sob um microscópio óptico para avaliar o tamanho e a saúde geral. Confirme que as células T apresentam algum agrupamento, morfologia aumentada e nenhum detrito ou fragmento celular visível.

Usando uma pipeta P1000, resuspenda as células T pipeteando várias vezes em cada canto do poço. Colete um tubo cônico e conte o número total de células T vivas CD8. Em seguida, coloque a suspensão de células T na centrífuga e gire a 584 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de células T em 10 mililitros de meio de cultivo de organoides de células T. Em seguida, transferir o número apropriado de células T para o tubo cônico contendo os VEOs previamente preparados para combinar as células. Coloque a suspensão combinada VEO e T-cell na centrífuga e gire novamente a 584 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Após descartar o sobrenadante, ressuspenda os VEOs e células T no volume apropriado do extrato da membrana basal. Depois, usando outra ponta de pipeta, placar a suspensão sobre a placa de cultura de tecidos pré-aquecida, dispensando 20 microlitros por poço para uma placa de 24 poços. Agora inverta a placa de cultura de tecidos e coloque-a de cabeça para baixo em um incubador a 37 graus Celsius.

Deixe 30 minutos para a adesão completa do extrato da membrana do embasamento e solidificação. Após o período de incubação, adicione cuidadosamente o meio completo de cultura organoide de células T suplementado a cada poço. Dispense 500 microlitros por poço para uma placa de 24 poços ou 250 microlitros por poço para uma placa de 96 poços, adicionando o meio contra a lateral do poço para evitar perturbar a gota de extrato da membrana do baso.

Substitua o meio de cultivo a cada dois dias até que as amostras sejam coletadas para análise de citometria de fluxo. VEOs de camundongos de sete dias de idade infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica, expressando proteína fluorescente amarela, apresentaram abundante replicação viral já quatro horas após a co-cultura, visível como os sinais fluorescentes dentro dos organoides. O acúmulo de células T CD8 próximo a organoides infectados tornou-se proeminente em momentos posteriores durante a co-cultura.

A agregação progressiva das células T CD8 esteve associada a uma redução visível do sinal de proteína fluorescente amarela em organoides infectados em momentos posteriores. Células T CD8 co-cultivadas com VEOs infectadas apresentaram aumento da expressão de CD69 e CD 103 ao longo do tempo, indicando a aquisição de um fenótipo de memória residente no tecido. Células T CD69 estimuladas por antígeno, CD103 positivas e CD8 apresentaram um aumento significativo na produção intracelular de interferon gama e interleucina 2 em comparação com controles não estimulados.

Esse protocolo permite o estudo in vitro de células T de memória residentes do CD8, possibilitando a manipulação eficiente de células epiteliais e células T sem depender de modelos animais. O desafio mais importante desse protocolo é manter células T e organoides epiteliais vaginais saudáveis e viáveis, pois a baixa viabilidade ou infecção comprometem a sobrevivência em cocultura e os resultados experimentais. Focamos na análise citométrica de fluxo, mas coculturas podem ser coletadas para coloração, imagem e sequenciamento.

A mídia segura permite o ELISA a jusante.