Preparação e Processamento de Artérias Calcificadas com Morfologia e RNA Preservados para Perfil Espacial Digital

A transcriptômica espacial oferece uma vantagem tanto sobre o seq de RNA unicelular quanto sobre o seq de RNA em massa, ao preservar informações espaciais dentro do tecido. Utilizando ferramentas como RNAscope, deconvolução computacional e conjuntos de dados de células únicas disponíveis publicamente, é possível mapear o comportamento celular para seu nicho e perfis gênicos e construir uma visão integrada da biologia tecidual. Essa tecnologia está explodindo.

Dois artigos da Nature de maio de 2025 focam em estudos de transcriptômica espacial. Se mapearmos o PubMed, a curva é ainda mais íngreme: cerca de 150 artigos espaciais em 2023, quase 300 em 2024, e está a caminho de ultrapassar 500 publicações em 2025. A transcriptômica espacial já remodelou várias áreas importantes de pesquisa, como biologia do câncer, neurociência, imunologia e biologia do desenvolvimento.

Ainda assim, a biologia vascular está atrasada. A heterogeneidade e a geometria única das artérias e veias as tornam desafiadoras para a fixação de tecidos e preservação do RNA. Além disso, lesões vasculares avançadas apresentam calcificação e trombose, que reduzem ainda mais a integridade dos tecidos.

Este protocolo foi especificamente projetado para estruturas semelhantes a embarcações. Também incluímos metodologias para reduzir o custo e os processos de coloração necessários para avaliar RNA, deposição de cálcio e células de interesse. Dada a atual escassez de estudos de transcriptômica espacial focados em vascular, em comparação com outras áreas, esse protocolo foi projetado para ser econômico e acessível para iniciantes, oferecendo aos pesquisadores vasculares ferramentas acessíveis para adotar a transcriptômica espacial em seus estudos.

Esse protocolo também é potencialmente útil para grandes amostras de coorte em experimentos clínicos. Neste protocolo, descrevemos procedimentos detalhados que abrangem o manuseio cuidadoso de tecidos artérias calcificados, métodos de calcificação de propriedades voltados para preservar a qualidade do RNA e a morfologia dos tecidos, técnicas de coloração para verificação e orientação durante a seleção do ROI, e a coloração final de marcadores morfológicos em lâminas preparadas, garantindo que estejam prontas para processamento no instrumento digital de perfilador espacial. Artérias tibiais humanas, incluindo as artérias tibial anterior, tibial posterior e perineal, foram colhidas de amostras de amputação de pacientes e armazenadas em DMEM contendo 1% HEPES e 1% Pen-Streptocócico.

Cada artéria é transferida para uma placa de Petri de 100 milímetros com o meio. O excesso de tecido conjuntivo perivascular é removido usando tesoura e pinças estéreis, restando apenas a parede arterial. A artéria aparada é transferida para uma nova placa de Petri.

Uma tábua de cortar estéril é preparada dentro da travessa. As artérias são cortadas em segmentos de um centímetro usando uma lâmina cirúrgica. Dois segmentos de cada artéria são congelados rapidamente em criotubos em nitrogênio líquido para criopreservação e armazenamento para futuros trabalhos com proteínas ou RNA.

Os segmentos restantes são colocados em tubos de 15 mililitros contendo formalina tamponada neutra a 10% e fixados a quatro graus Celsius por 24 a 48 horas. A solução de descalcificação com 10% de EDTA em uma solução estabilizadora de RNA é preparada, ajustando o pH para 5,2 para a solução de trabalho. Os tecidos fixos são transferidos para um novo prato contendo PBS, e os tecidos são brevemente lavados.

Cada amostra é transferida para um tubo de 15 mililitros contendo solução de descalcificação e agitada a quatro graus Celsius por 72 horas. Após a conclusão da descalcificação, as amostras são lavadas duas vezes usando PBS com agitação suave por cinco minutos. Os tecidos são transferidos para.

As fitas são colocadas em um processador de tecido. O processamento de formol é realizado por pelo menos quatro horas. O tempo pode variar dependendo da matriz de amostra.

Múltiplos segmentos de artéria são colocados por bloco. O bloco é preenchido com parafina e deixado esfriar completamente. Os slides são preparados marcando a área de tecido restrita nas costas dos slides.

Confirme que todos os segmentos estão dentro da área restrita exigida pelo instrumento GeoMx DSP. O excesso de parafina é aparado dos blocos. Os blocos são então seccionados a cinco micrômetros com lâminas de perfil baixo.

As fitas de tecido são montadas dentro da área marcada. Pelo menos quatro seções seriadas por bloco são montadas para diferentes colorações no experimento DSP. Armazene os lâminas a quatro graus Celsius até o uso.

Em seguida, a hibridização in situ por RNAscopo, bem como a coloração histológica, são realizadas em lâminas preparadas em série. Além disso, outro conjunto de lâminas é corado com marcadores morfológicos, como CD45 para células imunes e alfa-SMA para células musculares lisas. O procedimento de hibridização in situ do RNAscope consiste brevemente em quatro etapas principais: cozimento de lâminas como pré-tratamento, desparafinização e reidratação padrão, recuperação do alvo, hibridização da sonda com amplificação de sinal e coloração de corante para visualização de RNA.

Para validação histológica, tanto a coloração H&E quanto a coloração com Alizarina Vermelho S são realizadas para permitir a localização precisa dos depósitos de cálcio. Por fim, a coloração morfológica de marcadores é realizada com um protocolo padrão de imunohistoquímica para identificar as células de interesse, orientando a seleção do ROI. Neste estudo, dois protocolos baseados em EDTA foram comparados: um, 10% de EDTA sozinho por 72 horas, e dois, 10% de EDTA e solução estabilizadora de RNA para o mesmo período.

Morfologia e qualidade do RNA foram avaliadas por hibridização in situ por RNAscopo. Ambos os métodos preservaram a arquitetura dos vasos, mas lâminas tratadas com o EDTA e o coquetel de solução estabilizadora de RNA apresentaram sinais de RNA marcadamente mais fortes, como demonstrado no painel direito, indicando que a solução estabilizadora de RNA protege os transcritos enquanto a EDTA quela o fosfato de cálcio cristalino e amolece gradualmente a amostra sem ativar RNases. Com a estratégia de preservação de RNA otimizada e a qualidade confirmada, demonstramos as etapas para a coloração histológica para deposição de cálcio usando hematoxilina e eosina e Alizarina Vermelha S. A alizarina liga seletivamente sais iônicos de cálcio e muda de tonalidade do laranja para o vermelho tijolo, destacando sensibilmente micro e macro calcificações, embora forneça menos detalhes celulares e extracelulares da matriz do que a H&E.

Usar ambas as colorações maximiza informações estruturais e composicionais. Após a coloração por marcadores morfológicos, os slides são escaneados na plataforma GeoMx. O anticorpo CD45 marca células imunes, enquanto o músculo alfa-liso actina marca as células musculares lisas vasculares abundantes no meio.

Os ROIs selecionados abrangem aproximadamente de 100 a 150 núcleos com rendimento adequado de RNA. Os ROIs foram colocados adjacentes e distantes de áreas calcificadas para comparar padrões espaciais de expressão gênica relevantes para a calcificação medial da artéria tibial. Apesar de alguma perda de tecido durante as etapas de processamento de várias horas, múltiplos retornos de retorno de investimento adequados foram identificados em cada seção da artéria.

Para concluir, esse fluxo de trabalho abrange o manuseio do tecido arterial calcificado e a descalcificação por meio de validação, coloração e seleção de ROI para um estudo de transcriptômica espacial. Em particular, combinar H&E com coloração específica de cálcio por Alizarina garante a localização precisa da calcificação vascular e maximiza tanto a informação estrutural quanto composicional para a colocação do ROI. A análise de RNAscópico mostra que as seções arteriais descalcificadas permanecem em grande parte intactas com RNA suficiente.