Ultrassonografia Doppler para imagens ao vivo e quantificação da função vascular ovariana em camundongos

Esta pesquisa visa caracterizar o fluxo sanguíneo ovariano preovulatório na urina usando um método in vivo não invasivo. A área carece de métodos não invasivos para estudar a remodelação vascular ovariana em tempo real sem prejudicar a fisiologia normal em camundongos. Para começar, ligue a energia principal localizada na parte traseira do sistema de imagem.

Depois que o sistema inicializar, alterne o interruptor de espera do computador no lado esquerdo do cartucho para acordar o monitor e o computador. Conecte o transdutor MS700 à porta ativa do transdutor na unidade de imagem localizada na porta mais à direita. Alinhe o pino de trava do conector do transdutor com a ranhura na porta.

Empurra o conector totalmente e gire a alavanca de trava na posição vertical para fixá-lo. Inicie o software de análise clicando no ícone do software. Clique em Novo para criar um novo estudo e escolha o nome apropriado no menu suspenso.

Na janela de Informações do Estudo, insira o nome do estudo e nome da série. O pacote de aplicação é ovário e o pacote de medição é vascular. Assim que o programa abre e o transdutor é detectado automaticamente, selecione o pacote de aplicação de ovários.

Em seguida, aplique uma pequena quantidade de creme de eletrodo em cada um dos eletrodos para garantir o contato adequado para o monitoramento da frequência cardíaca. Uma vez que o animal esteja totalmente sedado, redirecione o fluxo de gás abrindo a torneira para o cone do nariz na plataforma de imagem e fechando a torneira para a câmara de indução. Transfira o mouse suavemente para a plataforma de imagem aquecida.

Coloque o camundongo na posição deitada com o lado dorsal voltado para cima e fixe o cone do nariz sobre o nariz para manter a anestesia. Coloque cada pé do creme de eletrodo na almofada correspondente para monitoramento fisiológico. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento da córnea durante a anestesia.

Confirme a profundidade adequada da anestesia usando o método do reflexo de beliscão do dedo do pé. Monitore os sinais vitais do animal, como a frequência respiratória e o batimento cardíaco, movimentos que indicam desconforto e a temperatura da plataforma a cada cinco minutos. Em seguida, raspe o quadrante inferior direito das costas usando um barbeador elétrico do membro traseiro direito até a linha média, mantendo-se lateral em relação à coluna.

Aplique uma camada fina de creme depilante corporal. Depois de um minuto, limpe bem o creme com gaze úmida. Depois, aplique uma camada generosa e uniforme de gel de ultrassom na região raspada.

Posicione a sonda transdutora em modo transversal em relação ao mouse no suporte mecânico, com a ranhura de orientação voltada para a esquerda do operador. Fixe a sonda no lugar usando a grampa. Pressione a tecla Modo B no painel de controle para ativar a janela padrão de imagem em tons de cinza.

Certifique-se de que o mouse e a plataforma estejam planos e que o transdutor seja perpendicular à superfície. Depois, puxe a pele para a esquerda e posicione o transdutor próximo à região superior raspada, mais próximo à linha média das costas. Abaixe o transdutor suavemente sobre a área raspada revestida com gel de ultrassom.

Alinhe a borda esquerda da sonda com a espinha e a borda direita sobre o flanco direito. Para identificar o ovário, primeiro identifique o rim, uma grande estrutura oval, cinza claro, com córtex e medula. Empurre a plataforma de imagem levemente em direção à cabeça do camundongo para revelar o ovário e o tecido adiposo periovariano.

Pressione o botão Cine Store para capturar o vídeo do Modo B. Agora, pressione a tecla do Modo Doppler de Potência no painel de controle para visualizar vasos sanguíneos com alta sensibilidade a fluxo de baixa velocidade. Ajuste o ganho Doppler para 32 a 55 decibéis, sensibilidade para 5, alcance dinâmico para 15 DR e velocidade para um quilohertz.

Mova a plataforma suavemente para frente e para trás para obter a melhor visão da vasculatura ovariana e identificar a artéria ovariana que entra no hilo ovariano, os vasos medulares na medula central e os vasos corticais ao redor dos folículos em desenvolvimento. Pressione Cine Store para salvar o vídeo exibido do ovário e da vasculatura no Modo Power Doppler. Para distinguir o fluxo arterial do venoso, pressione Modo Doppler colorido.

O vermelho mostra o fluxo em direção ao transdutor e o azul mostra o fluxo para longe dele. O vaso com maior velocidade média é a artéria ovariana. Pressione o botão Doppler Pulsed Wave PW para abrir as linhas de data da amostra.

Pressione novamente para ativar a Forma de Onda Espectral Doppler. Após posicionar a porta de amostra no centro do lúmen do vaso, ajuste o ângulo de insonação para ser menor ou igual a 60 graus e paralelo ao fluxo usando o botão de ângulo. Para a artéria ovariana, coloque a porta pouco antes de entrar no ovário.

Para o vaso medular, posicione-o na bifurcação central. Para vasos corticais, coloque-o na base de um folículo em crescimento. Pressione Cinema Store para salvar tanto a imagem do ultrassom quanto a forma de onda espectral.

Quando a imagem estiver pronta, remova o gel de ultrassom das costas e retire suavemente o rato da plataforma de imagem. E coloque o mouse em uma almofada térmica até estar totalmente acordado. A Imagem Doppler de potência revelou um aumento visível na profusão nos vasos medulares uma hora após a injeção humana de gonadotrofina coriônica, seguido por retorno ao estado de base em oito horas e uma diminuição adicional em 12 horas após a injeção.

A Imagem Doppler colorida permitiu diferenciação clara entre a artéria ovariana e a veia ovariana e melhorou a visualização da direção do fluxo dentro dos vasos ovarianos. Formas de onda Doppler PW representativas apresentaram ciclos distintos com velocidades sistólicas pico e diastólicas finais mensuráveis na artéria ovariana de um camundongo hormonalmente responsivo, enquanto um camundongo não responsivo exibiu traços de sinal baixo sem forma de onda detectável. Uma hora após a injeção humana de gonadotrofina coriônica, a velocidade do fluxo sanguíneo aumentou na artéria ovariana, vasos medulares e vasos corticais em camundongos que responderam à estimulação, mas nenhum aumento desse tipo foi observado no camundongo não responsivo.

Em camundongos não responsivos, a velocidade nos vasos corticais caiu abaixo do limiar de detecção em pontos de tempo selecionados indicados por valores provisórios atribuídos. Usando ultrassonografia Doppler, determinamos que a velocidade do fluxo sanguíneo ovariano aumenta rapidamente após o aumento de DLH em camundongos. A ultrassonografia Doppler permite uma avaliação repetida e não invasiva da hemodinâmica ovariana durante o período pré-ovulatório, o que outros métodos não conseguem alcançar.

Após caracterizar a hemodinâmica pré-ovulatória normal, estudos futuros podem agora usar esse protocolo para examinar interrupções do fluxo sanguíneo em modelos de distúrbios ovarianos como a SOP.