Name: Shrinky Dink-Hanging Drops: Uma maneira simples para formar e Cultura corpos embrióides (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a formar corpos embrióides usando microcâmaras fabricadas com Shrinky Dink para biologia de células-tronco. Este método simplificado permite controlar o número inicial de células e reduz o trabalho manual em comparação com a técnica de gota pendente.

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Gostaríamos de agradecer a CIRM para apoiar este trabalho. A linhagem celular foi generosamente doado pelo Dr. Andras Nagy no Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontário.

1. Fazendo Shrinky Dink-Mold <ol><li> Imprimir o padrão desejado na Shrinky dink folhas usando uma impressora boa definição. </li><li> Asse folha Shrinky dink-a 163 ° C por cerca de 10 minutos, ou até totalmente encolhido e tendo adquirido uma forma regular. </li><li> Depois Shrinky dink-molde ter arrefecido, submerge-o em um banho de isopropanol até que a superfície total é mal cobria. </li><li> Cuidadosamente, spray alguns acetona sobre o molde e agitar recipiente algumas vezes. Adicione mais isopropanol para lavar o excesso de acetona e repita este passo algumas vezes até Shrinky molde parece limpo. </li><li> Molde mergulhe em água destilada por 10 minutos para lavar qualquer solvente orgânico restantes. </li><li> Ar limpo Shrinky molde. Re-aquecer por aproximadamente 5 minutos a 163 ° C. Isso vai de tinta compacta e evaporar qualquer solvente restante. </li></ol> 2. Fazendo PDMS micropoços <ol><li> Prepare uma mistura de agente de 10:01 PDMS / cura e agita-se vigorosamente durante alguns minutos. </li><li> Molde lugar Shrinky dink em uma pequena placa de Petri. Despeje a mistura PDMS até atingir cerca de 1 / 2 cm sobre a superfície do molde. </li><li> Prato colocar sob sino de vácuo para eliminar todas as bolhas da mistura PDMS. </li><li> Prato coloque no forno a 70 ° C, durante a noite. </li><li> Cortadas PDMS sólidos de molde e vinculá-lo a uma lâmina de vidro apenas pela aplicação de pressão. </li><li> Descartar primeiro micropoços-chip, uma vez que tem resíduos de tinta incrustada entre PDMS. </li><li> Repita este procedimento para produzir um chip de segundo que é a tinta-livre e tem uma forma mais definida. </li><li> Limpa micropoços-chip utilizando solução de etanol 70%. Colocá-lo sob fonte de luz UV durante 10 minutos para esterilizá-lo. </li></ol> 3. Células Trapping em micropoços <ol><li> Contagem de células e diluí-los em meios de cultura para a concentração desejada (dependendo do número de células iniciais em poços que gostaria). Por exemplo, para obter cerca de 10-15 células por poço (média = 11, DP = 5,4, taxa de carregamento = 93%), foi utilizada uma concentração de 8 × 10 4 células / ml. Para uma concentração de 17 × 10 4 células / ml, poderíamos obter de forma confiável entre 25 e 35 células por poço (média = 27,17857 DP = 7,7, taxa de carregamento = 100%). </li><li> Cuidadosamente coloque chip de micropoços em um tubo de centrífuga de 50 ml contendo um solidificou base de PDMS. </li><li> Adicionar cerca de 2JDP ml da solução celular. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 760 rpm e 4 ° C. </li><li> Pipeta com excesso de solução e lavar cuidadosamente com PBS micropoços solução de 1X. </li><li> Coloque em um prato de micropoços Petry pequeno, sendo cuidado ao tirar o chip para fora do tubo de centrifugação. </li><li> Lavar o excesso de células usando um X solução PBS. </li><li> Lugar de chips micropoços sob um microscópio invertido para verificar o número pretendido de células por poço. </li><li> Incubar micropoços contendo células em condições normais. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="Figura-01" width="350" height="183" /></li></ol> 4. Incubação de células <ol><li> Seguir o protocolo EB normal no laboratório. </li><li> Mudar o meio devagar do lado da câmara; evitar a perturbação do celular na microplaca. </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

Nós desenvolvemos um método de cultura simples, rápida e escalável para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated (moldados a partir Shrinky-Dinks) e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides. Finalmente, essas células são facilmente acessíveis para posterior análise e experimentação. Este método é passível de qualquer laboratório e não exige equipamentos dedicados, porque evitaria a necessidade de fotolitografia. Podemos variar o tamanho dos poços, bem como a concentração de células / poços para alterar ...

Para a mídia MESC (McCloskey laboratório protocol): (para media total de preparo: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: 0,5 ml; 1ml 2mM de L-glutamina: 0,5 ml; NEAA 1ml: 0,5 ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50uL; 100ul diluído BME:. 50uL; 100ul (Adicionar 35ul da BME estéril filtrado a 5 ml de PBS e filtro de seringa esterilizar Descarte após 2 semanas. concentração final na solução é 0,1 mM)

shrinky dink-hanging drops: uma maneira simples para formar e cultura corpos embrióides

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Corpos embrióides (EB) são agregados de células-tronco embrionárias. A forma mais comum de criar esses agregados é o método de gota em suspensão, uma abordagem laboriosa de pipetagem um número arbitrário de células em placas bem. As interações entre as células-tronco forçado a estreita proximidade um do outro promove a geração dos EBs. Porque a mídia em cada um dos poços tem que ser trocado manualmente todos os dias, esta abordagem é manualmente intensivo. Além disso, porque os parâmetros ambientais, incluindo a célula-célula, as interações célula-soluble fator, pH, ea disponibilidade de oxigênio podem ser funções de tamanho EB, populações de células obtidas a partir tradicionais gotas de suspensão pode variar drasticamente, mesmo quando cultivadas em condições idênticas. Estudos recentes têm mostrado que na verdade o número inicial de células que formam o agregado pode ter efeitos significativos sobre a diferenciação de células-tronco. Nós desenvolvemos um método de cultura simples, rápida e escalável para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides. Finalmente, essas células são facilmente acessíveis para posterior análise e experimentação. Este método é passível de qualquer laboratório e não exige equipamentos dedicados. Nós demonstrar este método, criando corpos embrióides usando uma linha de células vermelhas fluorescentes mouse (129S6B6-F1).

Vamos mostrar um método simples e rápido para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides.

Shrinky Dink-Hanging Drops: Uma maneira simples para formar e Cultura corpos embrióides

Corpos embrioides (EB) são agregados de células-tronco embrionárias. A forma mais comum de criar esses agregados é o método da gota suspensa, um processo laborioso...

Os embrioides são agregados de células-tronco embrionárias. A maneira mais comum de criar esses agregados é o método da gota suspensa. Uma abordagem trabalhosa de pipetagem, com um número arbitrário de células em placas de poços.O processo é intensivo manualmente porque o meio e cada placa de poços precisam ser trocados manualmente a cada dia. Além disso, estudos recentes mostraram que o número inicial de células que formam o agregado pode influenciar a diferenciação das células-tronco. Não há como predeterminar o número de células utilizando este método.Neste vídeo, mostramos uma maneira simples e rápida de carregar diferentes números de células em poços microfabricados para o desenvolvimento de corpos em bordado. Olá, sou Jonathan Pagan do laboratório de Michelle K na Escola de Engenharia da Universidade da Califórnia em Merced, e sou Jesus Luna, também do laboratório de K. Hoje mostraremos um procedimento para criar corpos em bordado em poços microfabricados por meio de centrífuga.Este procedimento envolve as seguintes etapas: criar um dispositivo microscópico, carregar as células-tronco e alimentar as células-tronco. Então, vamos começar. O primeiro passo neste procedimento é fabricar o molde de shrinky dink utilizando uma impressora de alta definição.Imprima o padrão desejado em folhas de shrinky dink. Em seguida, asse a folha shrinky D a 160 graus Celsius por cerca de 10 minutos ou até que tenha encolhido completamente e adquirido uma forma regular. Após o molde de tinta encolhida ter esfriado por dois minutos e estiver frio ao toque.Mergulhe-o em um banho de isopropanol até que toda a superfície esteja levemente coberta. Depois que o molde de tinta retrátil tiver sido submerso no isopropanol, borrife cuidadosamente um pouco de acetona sobre o molde e agite o recipiente algumas vezes. Em seguida, adicione mais isopropanol para remover o excesso de acetona e repita este passo algumas vezes até que o molde de tinta retrátil pareça limpo.Em seguida, mergulhe o molde e água destilada por 10 minutos para remover qualquer solvente orgânico remanescente. Após a imersão em água, limpe o molde de tinta shrinky com ar comprimido e aqueça-o novamente por cerca de cinco minutos a 160 graus Celsius. Isso compactará a tinta e evaporará qualquer solvente remanescente.E agora podemos prosseguir para a confecção das micropoças de PDMS. Agora geramos as micropoças de PDMS, que serão usadas para cultivar as células-tronco para o desenvolvimento do embrioides. Prepare uma mistura de PDMS e agente de cura na proporção de 10 para 1 e agite vigorosamente por alguns minutos.Em seguida, despeje a mistura de PDMS sobre o molde de shrinky dink em uma pequena placa de Petri até atingir cerca de meio centímetro acima da superfície do molde. Após a aplicação do PDMS, bolhas frequentemente podem ser observadas sobre o molde, que devem ser removidas. Coloque a placa sob uma campânula de vácuo por 20 minutos para eliminar todas as bolhas da mistura de PDMS.Após garantir que todas as bolhas tenham sido removidas, coloque a placa no forno a sete graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, corte o PDMS sólido do molde com uma lâmina de barbear. Limpe-o usando fita adesiva e fixe-o a uma lâmina de vidro com os poços voltados para cima.Isso é feito simplesmente aplicando pressão nas bordas. Em seguida, limpe com solução de etanol 70% e coloque sob uma fonte de luz UV por 10 minutos, para esterilizá-lo.Na primeira vez que fizer isso, você descartará o PDMS. Isso ajudará a remover qualquer resíduo extra de tinta de seu molde. Você poderá usar o molde como está a partir de então.Repita o procedimento de moldagem mais uma vez para produzir um segundo chip livre de tinta e com uma forma mais definida. Certifique-se de aplicar uma descarga durante 20 segundos antes de iniciar, a fim de criar uma superfície hidrofílica para facilitar o carregamento. Após a fabricação das micropoças de PDMS, elas agora podem ser utilizadas para o estudo de corpos de Enid.Então vamos prosseguir. Para começar, as células devem ser contadas e diluídas em meio de cultura celular até a concentração desejada, o que depende do número de células iniciais que você deseja por poço. Na concentração de 1,5 vezes 10 à quarta células por mililitro, observamos que se obtém 14 células por poço com cada poço carregado.Adicione dois mililitros de solução celular a um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo uma base de PDMS solidificada. Coloque cuidadosamente o chip de poços microscópicos no tubo de centrífuga e centrifugue por cinco minutos a 760 RPM. Em seguida, pipete o meio e coloque o poço microscópico em uma pequena placa de Petri.Tenha cuidado para não derramar ao retirar o chip do tubo de centrífuga. Em seguida, coloque o chip de poços microscópicos sob um microscópio invertido para verificar se todos os poços estão carregados. Coloque o chip no suporte e incube os micro poços contendo células em condições padrão por 24 horas.Para manter as células, o meio pode ser trocado lentamente pelo lado da câmara após 24 horas. Evite perturbar as células no microplaca. Você pode fazer isso diariamente.A vantagem é que você pipeta apenas uma vez e troca todo o meio, ao contrário do método convencional de gotas suspensas, no qual é necessário trocar o meio de cada poço individualmente. Acabamos de mostrar como cultivar células e criar corpos de embrioides a partir de moldes de shrinky dink. Este método é extremamente útil porque é simples, rápido e manualmente menos trabalhoso do que o método de gota suspensa. Este método não requer fotolitografia.Além disso, podemos controlar o número de células de que partimos para criar nossos corpos bordados. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

shrinky-dink-hanging-drops-simple-way-to-form-culture-embryoid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra como realizar a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongos para corpos embrióides usando o método da gota pendente.

Na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (MES) células usando o método da gota de suspensão

Nós descrevemos um método simples e rápida de gerar tecido 3D-como esferóides e sua potencial aplicação para quantificar as diferenças de interações célula-célula.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As iPSCs humanas são induzidas a formar corpos embrióides (EBs). Os EBs são cultivados sobre um andaime de polímero usando um meio de indução, promovendo a diferenciação em células-tronco neurais, células progenitoras e neurônios imaturos. Finalmente, os EBs são embutidos em uma matriz e transferidos para um meio de manutenção para a formação de organoides cerebrais.

Geração de Organoides Cerebrais Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Este vídeo demonstra o processo de geração de bolas de neurônios usando uma técnica de cultura de gota suspensa. Dentro das gotas suspensas, as células se movem para o fundo, auto-montadas em estruturas tridimensionais formando bolas de neurônios, que podem ser usadas para estudos neurobiológicos.

Desenvolvendo bolas de neurônios usando uma técnica de cultura de gota suspensa

O vídeo demonstra a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) em corpos embrióides (EBs) pelo método de gota suspensa. Ao suspender as mESCs em gotas suspensas e incubadas, as células se agregam para formar EBs, que são posteriormente diferenciadas em células progenitoras neuronais (NPCs) usando um meio de diferenciação suplementado com ácido retinóico (RA).

Geração de progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos pelo método Hanging Drop

Este vídeo mostra a utilização de uma técnica de iluminação lateral de luz suave para melhorar a visualização a olho nu de corpos embrióides, facilitando assim sua manipulação e transferência durante a cultura de organoides cerebrais. Ele elucida a configuração da iluminação de luz suave, métodos para mudanças de mídia e transferência de corpos embrióides, bem como o procedimento para induzir a diferenciação neural em corpos embrióides para o desenvolvimento de organoides cerebrais.

Uma técnica para otimizar a cultura de organoides cerebrais usando iluminação lateral de luz suave

A cultura de gotículas verticais ex vivo é uma alternativa às técnicas experimentais atuais in vitro e in vivo. Este protocolo é fácil de executar e requer quantidades menores de reagente, ao mesmo tempo em que permite a capacidade de manipular e estudar a vascularização, morfogênese e organogênese fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

Aqui descrevemos um protocolo para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo gera organoides renais dentro de duas semanas. Os organoides renais resultantes podem ser cultivados em frascos rotadores em larga escala ou placas de agitação magnética multi-bem para abordagens paralelas de teste de drogas.

Um método simplificado para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Organoides cerebrais oferecem oportunidades sem precedentes para estudar o desenvolvimento de órgãos e a patologia da doença humana. Embora tenha sido alcançado grande sucesso com sistemas de cultura organoides cerebrais, ainda há dificuldades operacionais na aplicação dessa tecnologia. O presente protocolo descreve um procedimento organoide cerebral que facilita a mudança média e a transferência organoide.

Facilitando a cultura organoide cerebral através da iluminação lateral da luz suave

O presente protocolo fornece um procedimento passo a passo para a geração, manutenção e envelhecimento reprodutíveis de organoides cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Este método permite cultivar e amadurecer organoides cerebrais por longos períodos, o que facilita a modelagem dos processos envolvidos no envelhecimento cerebral e na patogênese relacionada à idade.

Fabricação robusta de tecidos para cultura de longo prazo de organoides cerebrais derivados de iPSC para pesquisa de envelhecimento

Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a geração e análise a jusante de organoides cerebrais humanos usando sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único.

Geração e análise a jusante de transcriptomas de célula única e núcleo único em organoides cerebrais

Aprenda a formar corpos embrióides usando microcâmaras fabricadas com Shrinky Dink para biologia de células-tronco. Este método simplificado permite controlar o número inicial de células e reduz o trabalho manual em comparação com a técnica de gota pendente.

Shrinky Dink-Hanging Drops: Uma maneira simples para formar e Cultura corpos embrióides

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