Name: Shrinky Dink-Hanging Drops: Uma maneira simples para formar e Cultura corpos embrióides (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a formar corpos embrióides usando microcâmaras fabricadas com Shrinky Dink para biologia de células-tronco. Este método simplificado permite controlar o número inicial de células e reduz o trabalho manual em comparação com a técnica de gota pendente.

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Gostaríamos de agradecer a CIRM para apoiar este trabalho. A linhagem celular foi generosamente doado pelo Dr. Andras Nagy no Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontário.

1. Fazendo Shrinky Dink-Mold <ol><li> Imprimir o padrão desejado na Shrinky dink folhas usando uma impressora boa definição. </li><li> Asse folha Shrinky dink-a 163 ° C por cerca de 10 minutos, ou até totalmente encolhido e tendo adquirido uma forma regular. </li><li> Depois Shrinky dink-molde ter arrefecido, submerge-o em um banho de isopropanol até que a superfície total é mal cobria. </li><li> Cuidadosamente, spray alguns acetona sobre o molde e agitar recipiente algumas vezes. Adicione mais isopropanol para lavar o excesso de acetona e repita este passo algumas vezes até Shrinky molde parece limpo. </li><li> Molde mergulhe em água destilada por 10 minutos para lavar qualquer solvente orgânico restantes. </li><li> Ar limpo Shrinky molde. Re-aquecer por aproximadamente 5 minutos a 163 ° C. Isso vai de tinta compacta e evaporar qualquer solvente restante. </li></ol> 2. Fazendo PDMS micropoços <ol><li> Prepare uma mistura de agente de 10:01 PDMS / cura e agita-se vigorosamente durante alguns minutos. </li><li> Molde lugar Shrinky dink em uma pequena placa de Petri. Despeje a mistura PDMS até atingir cerca de 1 / 2 cm sobre a superfície do molde. </li><li> Prato colocar sob sino de vácuo para eliminar todas as bolhas da mistura PDMS. </li><li> Prato coloque no forno a 70 ° C, durante a noite. </li><li> Cortadas PDMS sólidos de molde e vinculá-lo a uma lâmina de vidro apenas pela aplicação de pressão. </li><li> Descartar primeiro micropoços-chip, uma vez que tem resíduos de tinta incrustada entre PDMS. </li><li> Repita este procedimento para produzir um chip de segundo que é a tinta-livre e tem uma forma mais definida. </li><li> Limpa micropoços-chip utilizando solução de etanol 70%. Colocá-lo sob fonte de luz UV durante 10 minutos para esterilizá-lo. </li></ol> 3. Células Trapping em micropoços <ol><li> Contagem de células e diluí-los em meios de cultura para a concentração desejada (dependendo do número de células iniciais em poços que gostaria). Por exemplo, para obter cerca de 10-15 células por poço (média = 11, DP = 5,4, taxa de carregamento = 93%), foi utilizada uma concentração de 8 × 10 4 células / ml. Para uma concentração de 17 × 10 4 células / ml, poderíamos obter de forma confiável entre 25 e 35 células por poço (média = 27,17857 DP = 7,7, taxa de carregamento = 100%). </li><li> Cuidadosamente coloque chip de micropoços em um tubo de centrífuga de 50 ml contendo um solidificou base de PDMS. </li><li> Adicionar cerca de 2JDP ml da solução celular. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 760 rpm e 4 ° C. </li><li> Pipeta com excesso de solução e lavar cuidadosamente com PBS micropoços solução de 1X. </li><li> Coloque em um prato de micropoços Petry pequeno, sendo cuidado ao tirar o chip para fora do tubo de centrifugação. </li><li> Lavar o excesso de células usando um X solução PBS. </li><li> Lugar de chips micropoços sob um microscópio invertido para verificar o número pretendido de células por poço. </li><li> Incubar micropoços contendo células em condições normais. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="Figura-01" width="350" height="183" /></li></ol> 4. Incubação de células <ol><li> Seguir o protocolo EB normal no laboratório. </li><li> Mudar o meio devagar do lado da câmara; evitar a perturbação do celular na microplaca. </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

Nós desenvolvemos um método de cultura simples, rápida e escalável para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated (moldados a partir Shrinky-Dinks) e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides. Finalmente, essas células são facilmente acessíveis para posterior análise e experimentação. Este método é passível de qualquer laboratório e não exige equipamentos dedicados, porque evitaria a necessidade de fotolitografia. Podemos variar o tamanho dos poços, bem como a concentração de células / poços para alterar ...

Para a mídia MESC (McCloskey laboratório protocol): (para media total de preparo: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: 0,5 ml; 1ml 2mM de L-glutamina: 0,5 ml; NEAA 1ml: 0,5 ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50uL; 100ul diluído BME:. 50uL; 100ul (Adicionar 35ul da BME estéril filtrado a 5 ml de PBS e filtro de seringa esterilizar Descarte após 2 semanas. concentração final na solução é 0,1 mM)

shrinky dink-hanging drops: uma maneira simples para formar e cultura corpos embrióides

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Corpos embrióides (EB) são agregados de células-tronco embrionárias. A forma mais comum de criar esses agregados é o método de gota em suspensão, uma abordagem laboriosa de pipetagem um número arbitrário de células em placas bem. As interações entre as células-tronco forçado a estreita proximidade um do outro promove a geração dos EBs. Porque a mídia em cada um dos poços tem que ser trocado manualmente todos os dias, esta abordagem é manualmente intensivo. Além disso, porque os parâmetros ambientais, incluindo a célula-célula, as interações célula-soluble fator, pH, ea disponibilidade de oxigênio podem ser funções de tamanho EB, populações de células obtidas a partir tradicionais gotas de suspensão pode variar drasticamente, mesmo quando cultivadas em condições idênticas. Estudos recentes têm mostrado que na verdade o número inicial de células que formam o agregado pode ter efeitos significativos sobre a diferenciação de células-tronco. Nós desenvolvemos um método de cultura simples, rápida e escalável para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides. Finalmente, essas células são facilmente acessíveis para posterior análise e experimentação. Este método é passível de qualquer laboratório e não exige equipamentos dedicados. Nós demonstrar este método, criando corpos embrióides usando uma linha de células vermelhas fluorescentes mouse (129S6B6-F1).

Vamos mostrar um método simples e rápido para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides.

Shrinky Dink-Hanging Drops: Uma maneira simples para formar e Cultura corpos embrióides

Corpos embrioides (EB) são agregados de células-tronco embrionárias. A forma mais comum de criar esses agregados é o método da gota suspensa, um processo laborioso...

Os embrioides são agregados de células-tronco embrionárias. A maneira mais comum de criar esses agregados é o método da gota suspensa. Uma abordagem trabalhosa de pipetagem, com um número arbitrário de células em placas de poços.O processo é intensivo manualmente porque o meio e cada placa de poços precisam ser trocados manualmente a cada dia. Além disso, estudos recentes mostraram que o número inicial de células que formam o agregado pode influenciar a diferenciação das células-tronco. Não há como predeterminar o número de células utilizando este método.Neste vídeo, mostramos uma maneira simples e rápida de carregar diferentes números de células em poços microfabricados para o desenvolvimento de corpos em bordado. Olá, sou Jonathan Pagan do laboratório de Michelle K na Escola de Engenharia da Universidade da Califórnia em Merced, e sou Jesus Luna, também do laboratório de K. Hoje mostraremos um procedimento para criar corpos em bordado em poços microfabricados por meio de centrífuga.Este procedimento envolve as seguintes etapas: criar um dispositivo microscópico, carregar as células-tronco e alimentar as células-tronco. Então, vamos começar. O primeiro passo neste procedimento é f

shrinky-dink-hanging-drops-simple-way-to-form-culture-embryoid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra como realizar a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongos para corpos embrióides usando o método da gota pendente.

Na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (MES) células usando o método da gota de suspensão

Nós descrevemos um método simples e rápida de gerar tecido 3D-como esferóides e sua potencial aplicação para quantificar as diferenças de interações célula-célula.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As iPSCs humanas são induzidas a formar corpos embrióides (EBs). Os EBs são cultivados sobre um andaime de polímero usando um meio de indução, promovendo a diferenciação em células-tronco neurais, células progenitoras e neurônios imaturos. Finalmente, os EBs são embutidos em uma matriz e transferidos para um meio de manutenção para a formação de organoides cerebrais.

Geração de Organoides Cerebrais Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Este vídeo demonstra o processo de geração de bolas de neurônios usando uma técnica de cultura de gota suspensa. Dentro das gotas suspensas, as células se movem para o fundo, auto-montadas em estruturas tridimensionais formando bolas de neurônios, que podem ser usadas para estudos neurobiológicos.

Desenvolvendo bolas de neurônios usando uma técnica de cultura de gota suspensa

O vídeo demonstra a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) em corpos embrióides (EBs) pelo método de gota suspensa. Ao suspender as mESCs em gotas suspensas e incubadas, as células se agregam para formar EBs, que são posteriormente diferenciadas em células progenitoras neuronais (NPCs) usando um meio de diferenciação suplementado com ácido retinóico (RA).

Geração de progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos pelo método Hanging Drop

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação de corpos embrióides (EBs) em agregados neuroepiteliais e sua subsequente divisão em células neuronais e gliais. Este método permite a geração eficiente de células neuronais e gliais in vitro, que servem como sistemas de teste para testes de toxicidade, bem como avaliação de diferentes vias envolvidas na neurotoxicidade.

Geração de neurônios e células gliais a partir de corpos embrióides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Este vídeo mostra a utilização de uma técnica de iluminação lateral de luz suave para melhorar a visualização a olho nu de corpos embrióides, facilitando assim sua manipulação e transferência durante a cultura de organoides cerebrais. Ele elucida a configuração da iluminação de luz suave, métodos para mudanças de mídia e transferência de corpos embrióides, bem como o procedimento para induzir a diferenciação neural em corpos embrióides para o desenvolvimento de organoides cerebrais.

Uma técnica para otimizar a cultura de organoides cerebrais usando iluminação lateral de luz suave

A cultura de gotículas verticais ex vivo é uma alternativa às técnicas experimentais atuais in vitro e in vivo. Este protocolo é fácil de executar e requer quantidades menores de reagente, ao mesmo tempo em que permite a capacidade de manipular e estudar a vascularização, morfogênese e organogênese fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

Nós descrevemos uma técnica para usar células-tronco embrionárias murinas para gerar dois ou três corpos embrióides dimensionais. Em seguida, explicar como induzir a diferenciação neuronal das células do corpo embrióides por ácido retinóico, e como para analisar o seu estado de diferenciação por imunofluorescência marcador de células progenitoras e imunotransferência.

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Aqui descrevemos um protocolo para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo gera organoides renais dentro de duas semanas. Os organoides renais resultantes podem ser cultivados em frascos rotadores em larga escala ou placas de agitação magnética multi-bem para abordagens paralelas de teste de drogas.

Um método simplificado para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a geração e análise a jusante de organoides cerebrais humanos usando sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único.

Geração e análise a jusante de transcriptomas de célula única e núcleo único em organoides cerebrais

Aprenda a formar corpos embrióides usando microcâmaras fabricadas com Shrinky Dink para biologia de células-tronco. Este método simplificado permite controlar o número inicial de células e reduz o trabalho manual em comparação com a técnica de gota pendente.

Shrinky Dink-Hanging Drops: Uma maneira simples para formar e Cultura corpos embrióides

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