Um modelo de camundongo neonatal de enterocolite necrosante e isolamento da lâmina própria para perfil de células imunes

Nossa pesquisa foca na doença que afeta bebês medicamente frágeis chamada enterocolite necrosante. Nosso objetivo é descobrir os mecanismos envolvidos na resposta imune na NEC e desenvolver estratégias para diagnóstico precoce e prevenção da doença. É muito desafiador estudar as respostas das células imunes intestinais na NEC neonatal. Nosso protocolo preenche essa lacuna demonstrando como isolar células imunes da lâmina própria para análise via citometria de fluxo.

Para começar, adquira uma cultura de bactérias entéricas cultivada de um bebê com enterocolite total necrosante, ou NEC. No dia experimental 0, às 15h, pipeteie uma alíquota de 20 microlitros da cultura em um tubo de cultura de 15 mililitros contendo 2 mililitros de caldo Luria-Bertani. Incube a cultura bacteriana a 37 graus Celsius por 16 horas em um agitador orbital ajustado para 1G, garantindo que a tampa do tubo permaneça em posição ventilada.

Simultaneamente, incube um segundo tubo de cultura contendo apenas 2 mililitros de caldo Luria-Bertani como controle para verificar qualquer contaminação. No dia seguinte, às 7h, pipete 125 microlitros da cultura bacteriana durante a noite em um frasco de cultura de células T75 com tampa ventilada contendo 25 mililitros de caldo Luria-Bertani. Prepare um total de quatro frascos T75 e incube em posição vertical a 37 graus Celsius por duas horas em um shaker orbital ajustado a 1G.

Às 9h, nos dias experimentais 1, 2 e 3, combine 16 mililitros de fórmula infantil com 8 mililitros de leite de cachorro em um tubo centrífugo estéril de 50 mililitros para preparar a mistura da fórmula. Remova o sobrenadante de dois tubos centrífugos de 50 mililitros contendo a cultura bacteriana em pellets. Resuspenda cuidadosamente cada um dos dois pellets em 2 mililitros da mistura preparada para fórmula.

Em seguida, transfere ambas as misturas ressuspensas para a fórmula restante para criar um total de 24 mililitros de fórmula NEC. Rotule seis tubos de centrífuga de 50 mililitros com os seis pontos de tempo de alimentação. Pipete 4 mililitros da fórmula NEC em cada um dos seis tubos rotulados.

Em seguida, prepare seis alíquotas de uso único de estoque de lipopolissacarídeos a 5 miligramas por mililitro e armazene em microtubos de baixa ligação a 20 graus Celsius. Logo antes da alimentação, descongele uma alíquota de lipopolissacarídeo e o vórtice por 15 segundos. Adicione um volume calculado do lipopolissacarídeo a um tubo de fórmula NEC de 4 mililitros e misture bem pipetando.

Encha uma seringa de 1 mililitro com a fórmula preparada do NEC e conecte-a a uma linha PICC neonatal. Para administrar a fórmula NEC a cada filhote por meio de gavage oral, segure suavemente o filhote pela pele frouxa na base do pescoço e mantenha-o ereto. A distância de inserção da linha PICC é igual à distância do canto da boca até o topo da mancha de leite no estômago.

O ponto ideal de inserção na linha PICC deve ser marcado com marcador permanente. Usando pinças, guie a linha PICC até a orofaringe e desça até o estômago. Se houver resistência, remova a linha PICC, reposicione-a e tente reinseri-la.

Dispense 80 microlitros da fórmula NEC lentamente no estômago. Monitore o filhote para sinais de aspiração durante a alimentação. Após a alimentação, remova a linha PICC e observe o filhote para respirar com dificuldade ou vômito.

Se ocorrer regurgitação, limpe a boca e o nariz do filhote com um lenço de laboratório com pouca calcinha. Repita o processo de alimentação em todos os momentos de alimentação. No quarto dia experimental, obtém o tecido intestinal dos camundongos neonatais eutanasiados.

Com uma tesoura, corte o intestino longitudinalmente para abri-lo e depois divida transversalmente em segmentos de 1 a 1,5 centímetro. Transfira os segmentos intestinais para um tubo centrífugo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de solução pré-digestiva que tenha sido resfriada no gelo. Em seguida, incube o tubo a 37 graus Celsius com rotação contínua por 20 minutos para iniciar a dissociação do tecido.

Gire suavemente o tubo para desalojar o tecido solto, depois despeje o conteúdo por um filtro de células de 100 micrômetros colocado sobre um tubo centrífugo de 50 mililitros. Transfira os fragmentos restantes de tecido para um novo tubo centrífugo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de solução digestiva pré-aquecida a 37 graus Celsius. Incube a amostra com rotação contínua por 40 minutos a 37 graus Celsius.

Depois, transfira o conteúdo para um tubo automatizado de dissociação de tecido. Execute o programa com quatro ciclos de rotação alternados de 15 segundos, alternando no sentido horário e anti-horário. Quando a dissociação estiver completa, faça um vórtice suave na suspensão celular no tubo de dissociação e depois centrifuge-a a 300G por 5 minutos a 4 graus Celsius.

Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem mexer na bola. Resuspenda as células em 1 mililitro de tampão de separação celular ativado por fluorescência gelada. Coloque um filtro de célula de 100 micrômetros sobre um tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Transfira as células ressuspensas pelo peneiro e lave com 2 mililitros de tampão de separação de células ativado por fluorescência fria. Conte as células isoladas e avalie a viabilidade usando azul de tripano ou um corante de viabilidade. Centrifuge o volume desejado para citometria de fluxo a 300G por 5 minutos a 4 graus Celsius.

Observou-se uma redução significativa na sobrevivência no grupo de tratamento com NEC em comparação com os controles alimentados por barragem. O exame intestinal grosseiro de camundongos com NEC revelou características características marcantes da NEC, incluindo sinais visíveis de distensão, acúmulo de ar e pneumatose intestinal em comparação com controles saudáveis. A coloração por hematoxilina e eosina revelou destruição vilosa fragmentada e arquitetura intestinal desorganizada em camundongos NEC em comparação com vilosidades intactas nos controles.

A expressão de RNA mensageiro IL1B, CXCL2 e LCN2 foi significativamente maior no grupo NEC do que nos controles. O total de células imunes CD45+ na lâmina própria intestinal não foi significativamente diferente entre os grupos NEC e controle. Os níveis de macrófagos foram significativamente elevados nos intestinos NEC em comparação com os controles.

Os camundongos NEC apresentaram uma proporção aumentada de células mieloides, particularmente monócitos e macrófagos, em relação a outros subtipos imunológicos. Abordagens multiômicas de célula única estão descobrindo assinaturas celulares imunes na NEC, oferecendo novos insights sobre mecanismos e potenciais biomarcadores. Modelar a NEC é desafiador porque a doença é multifatorial.

Replicar o ambiente intestinal humano, as respostas imunes e as influências microbianas em camundongos neonatais requer uma otimização cuidadosa. Nosso modelo integra microbioma de origem humana, hipóxia e alimentação com fórmula, tornando-o fisiologicamente relevante, alinhado para um perfil detalhado das células imunológicas em camundongos neonatais.