Avaliação da Dinâmica de Fissão/Fusão Mitocondrial em Células Tubulares Proximais Renais

No nosso laboratório, nosso objetivo é transplantar mitocôndrias para órgãos lesionados para recuperá-los. Por isso estamos desenvolvendo um novo protocolo operacional para isolar mitocôndrias eficientes e dinamicamente ativas. Os desafios incluem acompanhar mitocôndrias transplantadas sem coração, enquanto avaliam com precisão sua integração, funcionalidade e comportamento dinâmico com as novas células receptoras.

Para iniciar a semente das células tubulares proximais renais em placas de cultura de fundo de vidro. Incube as células durante a noite para permitir a adesão e o crescimento. No dia seguinte, adicione Cisplatina à placa experimental até uma concentração final de dois micromolares.

Em seguida, configure os lasers de um microscópio confocal para 405 nanômetros, 488 nanômetros para excitação Dendra2 não convertida e 561 nanômetros. Ligue os lasers e deixe aproximadamente 10 minutos para estabilização. Coloque o disco de cultura na câmara de incubação.

Adicione água ao redor da câmara e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius, garantindo que o fornecimento de dióxido de carbono seja mantido. Permita que a câmara de incubação se equilibre antes da imagem. Visualize as células usando maior ampliação e resolução para imagens mitocondriais.

Abra o menu suspenso no canto superior esquerdo e selecione as Opções FRAP. Usando o software LAS X, defina a região de interesse onde o clareamento fotográfico será realizado. Agora, aplique um pulso de laser de alta intensidade para branquear a região de interesse, ajustando os lasers FRAP para 405 nanômetros em 4,00, 488 nanômetros para 0,00.

E 561 nanômetros a 0,00. Defina o pré-branqueamento para 5,140 segundos para 59 iterações e defina o tempo pós-descolorimento. Para imagens pós-branqueamento, continue adquirindo imagens em baixa intensidade laser por 10 minutos usando lasers FRAP a 405 nanômetros a 0,00, 488 nanômetros a 0,50.

E 561 nanômetros a 0,50. Para perfilar as mitocôndrias verdes e vermelhas fundidas, primeiro instale o plug-in RGB Profiler. Abra o software ImageJ, depois no menu Arquivo, localize e abra o arquivo de imagem para analisar.

Selecione o modo de cor Composto, marque a opção Autoscale e abra a pilha de vídeo ou imagem para analisar. Desenhe uma área retangular sobre a imagem e clique com o botão direito para selecionar Duplicar. Selecione a opção Duplicar hiperpilha para duplicar todas as pilhas de imagens.

Selecione a imagem e escolha RGB no menu suspenso Imagem para converter a pilha duplicada para o formato RGB. Duplique a imagem RGB e selecione apenas um quadro. Se as mitocôndrias parecerem curvas, desenhe uma linha ao longo do comprimento delas, vá ao menu de editar, escolha Seleção e clique em Endireitar.

Agora, escolha um título para a imagem retificada e defina a largura da linha para 20 pixels. Desenhe uma linha ao longo da mitocôndria endireitada para alinhá-la corretamente. E abra o plugin RGB Profiler.

Uma vez ativado, o plug-in gerará um gráfico mostrando intensidades de fluorescência vermelha e verde ao longo da linha desenhada. A altura de cada pico será diretamente proporcional à intensidade de fluorescência. Após a fusão, confirme que a fluorescência vermelha se espalhou para a mitocôndria verde adjacente, indicando mistura de conteúdo.

Verifique se o gráfico de intensidade agora mostra picos vermelhos e verdes sobrepostos. Para avaliar a fusão, selecione mitocôndrias saudáveis e mitocôndrias fotobranqueadas para fusão em imagens de células vivas. Monitore a mudança na razão de fluorescência vermelho-verde ao longo do tempo para indicar eventos de fusão.

As células controle apresentaram mitocôndrias alongadas com matriz amarela, indicando fusão mitocondrial das matrizes vermelha e verde. Células tratadas com cisplatina apresentaram mitocôndrias fragmentadas com sobreposição reduzida de sinais vermelhos e verdes, sugerindo fusão comprometida. A recuperação da fluorescência na região fotodescolorida diminuiu ao longo do tempo nas células controle, indicando fusão mitocondrial ativa.

As células tratadas com cisplatina mantiveram uma razão de fluorescência quase estável, indicando fusão mitocondrial comprometida. A expressão do CLRS-1 foi significativamente reduzida em células tratadas com cisplatina em comparação com os controles. O uso da expressão celular de fluorescência e mitocôndrias fotocomutáveis nos ajuda a acompanhar as mitocôndrias e avaliar sua dinâmica nas células receptoras.

A medição da morfologia das mitocôndrias em células vivas revela saúde celular em tempo real, marcação genética e proteínas fotocomutáveis aumentam a precisão e a robustez. Pesquisas futuras explorarão mecanismos celulares, tanto mitocondrítricos quanto citoplasmáticos, que coordenam remodelação para moldar mitocôndrias tubulares, esféricas ou circulares.