Imagem de células vivas do transporte endocítico usando nanocorpos funcionalizados em células cultivadas

Estamos estudando o tráfego endocítico e retrógrado das proteínas transmembranas, bem como a maquinaria que confere o transporte. Para investigar o tráfego de proteínas a partir da superfície celular, anticorpos convencionais são tipicamente utilizados, mas eles podem promover a reticulação cruzada e o direcionamento lisossômico. Para começar, obtenha um pellet de bactérias Escherichia coli transformado com VHH-mCherry.

Adicione 30 mililitros de tampão de ligação a frio com gelo contendo 20 milimolares de imidazol em PBS ao pellet de células bacterianas. Com uma pipeta, ressuspenda completamente o pellet, pipeteando para cima e para baixo. Transfira a mistura ressuspensa para um tubo de centrífuga de 50 mililitros rotulado.

Suplemente as células ressuspensas com 200 microgramas por mililitro de lisozima, 20 microgramas por mililitro de DNase I, um cloreto de magnésio milimolar e um milimolar fenilmetilsulfonil fluoreto. Após incubar o tubo em temperatura ambiente por 10 minutos, coloque-o em um rotador extremo sobre extremo e continue a incubação a quatro graus Celsius por uma hora. Em seguida, insira uma ponta sólida de sonda de seis milímetros diretamente na suspensão da célula.

Interrompa mecanicamente as células bacterianas usando três pulsos de sonicação de um minuto com 40% de amplitude e um ciclo de trabalho de um segundo ligado e um segundo desligado. Permitindo um intervalo de resfriamento de um minuto entre cada pulso. Após a centrifugação, mantenha o lisado liberado no gelo enquanto se prepara para cromatografia de afinidade metálica imobilizada usando colunas pré-embaladas e de uso único para purificação de etiquetas, projetadas para operação por fluxo gravitacional.

Fixe colunas de ácido níquel-nitrilotriacético em um suporte metálico ou em um suporte apropriado para a coluna. Depois, esvazia completamente o buffer de armazenamento da coluna. Equilibre a coluna adicionando 10 mililitros de tampão de ligação contendo 20 milimolares imidazol em PBS.

Deixe o buffer passar por gravidade. Aplique gradualmente aproximadamente 30 mililitros do lisato bacteriano eliminado na coluna equilibrada. Deixe que ele passe pela gravidade e descarte o fluxo.

Em seguida, lave a coluna aplicando dois volumes consecutivos de 10 mililitros de tampão de ligação contendo 20 milimolares de imidazol em PBS. Elude os nanocorpos ligados aplicando dois mililitros de tampão de elução contendo 500 milimolares de imidazol em PBS em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Equilibre uma coluna de dessalinização semeada em um adaptador de tubo de 50 mililitros enxaguar cinco vezes com cinco mililitros de PBS.

Deixe o buffer entrar totalmente na resina compactada, depois descarte o fluxo. Após a última lavação, centrifuge a coluna a 1000 x g por dois minutos. Agora mova a coluna com seu adaptador para um novo tubo coletor de 50 mililitros após descartar o fluxo.

Carregue dois mililitros do nanocorpo funcionalizado eluído na coluna de dessalinização pré-equilibrada. Depois, centrifuge novamente a 1000 x g por dois minutos para coletar o eluato antes de validar a expressão e pureza do VHH-mCherry. Inicie o software do sistema automatizado de imagem de células vivas.

Transfira a câmara de microscopia ibidi para o palco do microscópio. Configure dois canais de imagem usando filtros de excitação e emissão para EGFP e mCherry. Escolha um tempo de exposição curto e baixa intensidade de iluminação para evitar descolorimento fotográfico.

Mantenha as configurações constantes para todos os experimentos. As configurações podem variar entre os repórteres. Para cada condição, armazene coordenadas de 10 campos de visão diferentes contendo de três a quatro células em foco em uma lista de pontos.

Depois, capture um único instantâneo de cada posição na lista de pontos para servir como imagem de referência antes de adicionar o VHH-mCherry. Para iniciar a endocitose, adicione suavemente 350 microlitros de solução pré-aquecida de VHH-mCherry em cada poço, minimizando a perturbação na monocamada. Depois, prossiga com a aquisição da imagem.

Realize uma aquisição em time-lapse para 100 quadros em 32º intervalo, mantendo 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para analisar a captação endocítica do VHH-mCherry, carregue os conjuntos de imagens em time-lapse no software de análise de imagens. Aplique ferramentas de segmentação e rastreamento para quantificar a fluorescência internalizada ao longo do tempo em diferentes regiões de interesse.

Todas as variantes funcionalizadas de nanocorpos foram purificadas para alto rendimento e pureza, com apenas o VHH-mCherry apresentando degradação proteolítica menor. Os produtos de degradação do VHH-mCherry foram confirmados como domínios individuais do VHH-mCherry usando detecção de imunoblot específico do epítopo. Na ausência de BirA, o VHH-mCherry foi recuperado em aproximadamente 20 miligramas por preparação.

E a biotinilação foi confirmada pela puxagem de agarose por estreptavidina em misturas de nanocorpos BSA. Proteínas de fusão marcadas com EGFP expressas em células HeLa apresentaram padrões de localização subcelular consistentes com seus equivalentes endógenos, incluindo a localização perinuclear de EGFP-CDMPR e EGFP-CIMPR. Localização perinuclear exclusiva do EGFP-TGN46 e localização periférica do TfR-EGFP.

O VHH-mCherry possibilitou visualização de células vivas do transporte endocítico do EGFP-CDMPR, mostrando aumento da colocalização ao longo de 60 minutos. A absorção de VHH-mCherry em células expressoras de EGFP-CDMPR atingiu um platô após aproximadamente 43 minutos, com meia-vida de nove minutos. Em células que expressam TfR-EGFP, VHH-mCherry acumulou-se rapidamente intercelularmente com meia-vida de quatro minutos e saturação após 20 minutos.

Estabelecemos um kit versátil de ferramentas baseado em nanocorpos para analisar o transporte de qualquer proteína transmembranar a partir da superfície celular. Usamos nanocorpos fluorescentes para marcar proteínas de carga de superfície e depois estudamos seu tráfego endocítico por microscopia de células vivas. Com nossa abordagem de imagem de células vivas baseada em nanocorpos, queremos descobrir caminhos que impulsionam o transporte de carga da superfície para a rede trans-Golgi.