Name: Imagem de células vivas do transporte endocítico usando nanocorpos funcionalizados em células cultivadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a visualizar o transporte endocítico em células HeLa usando nanocorpos VHH-mCherry funcionalizados. Este método permite quantificar a dinâmica de proteínas transmembrana em tempo real por microscopia de células vivas.

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<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-GFP &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>O produto é distribuído pela Sigma-Aldrich, mas fabricado pela Roche</td></tr><tr><td>Pratos de cultura celular de 100 mm</td><td>TPP</td><td>TPP93100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-actina</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-HA</td><td>do laboratório</td><td>feito a partir do híbridoma 12CA5</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-His6</td><td>Laboratórios Bethyl & nbsp;</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-T7 &nbsp;</td><td>Laboratórios Bethyl & nbsp;</td><td>A190-117A</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent&nbsp;E. coli</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Diidratado de cloreto de cálcio</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>dissolvido em água estéril, o estoque é de 1 M</td></tr><tr><td>Carbenicilina sal dissódico</td><td>Aplichem</td><td>A1491</td><td>dissolvido em água estéril, o caldo é 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Coomassie-R (Azul Brilhante)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>D-biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>dissolvido em NaH2PO4 ou DMSO estéril de 500 mM,</td></tr><tr><td>Colunas descartáveis PD10 de dessalinização</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX-I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, sem glutamina, sem fenol vermelho</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Aplichem</td><td>A3778</td><td>dissolvido em água estéril</td></tr><tr><td>Dulbecco' s soro tampão fosfatado (DPBS) sem Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S, PES, Porengr&ouml; &szlig; e: 0,45 & micro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção FuGENE HD</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Coberturas de vidro (nº 1.5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>HRP anti-camundongo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coelho de cabras HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>Seu kit de proteção</td><td>Cytvia</td><td>11003400</td><td></td></tr><tr><td>Suas colunas GraviTrap</td><td>Cytvia</td><td>11003399</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Slide 4 bem, ibiTreat</td><td>80426-IBI</td><td>ibidi</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil-&beta;-D-tiogalactopiranoside (IPTG)</td><td>Aplichem</td><td>A1008</td><td>dissolvido em água estéril, o estoque é de 1 M</td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Aplichem</td><td>A1493</td><td>dissolvido em água estéril, o caldo é 100 mg/mL</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Aplichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>O produto é distribuído pela Sigma-Aldrich, mas fabricado pela Roche</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>dissolvido em água estéril, o estoque é de 1 M</td></tr><tr><td>Mini géis proteicos TGX, 4-20%, 15-poço</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>HeLa Kyoto modificado</td><td>do laboratório</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB5-alpha Competent&nbsp;E. coli</td><td>NEB</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 preparações</td><td>Macherey-Nagel&nbsp;</td><td>740412.1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Bioconceito&nbsp;</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF)</td><td>Aplichem</td><td>A0999.0025</td><td>dissolvido em DMSO a 40%, 60% isopropanol, estoque em 500 mM</td></tr><tr><td>Linha celular Phoenix ampho</td><td>Laboratório Nolan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polibrena (brometo de hexadimetrina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invivogen</td><td>ANT-PR-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio &nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>dissolvido em água estéril, o estoque tem 5 M</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Pack, mini</td><td>Bio-Rad</td><td>1704158</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Aplichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura & nbsp;</td><td>Aplichem</td><td>A1552</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de células vivas do transporte endocítico usando nanocorpos funcionalizados em células cultivadas

Live-cell Imaging of Endocytic Transport using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Para investigar o tráfego retrógrado de proteínas para vários compartimentos intracelulares, estabelecemos recentemente uma ferramenta baseada em nanocorpos anti-GFP para rotular e rastrear proteínas de fusão recombinantes da superfície celular17. Aqui, descrevemos a produção bacteriana de tais nanocorpos derivatizados e demonstramos sua utilidade no monitoramento da captação endocítica por imagens de células vivas. Em combinação com um repórter fluorescente residente em Golgi, este protocolo oferece uma plataforma robusta para estudar quantitativamente o transporte retrógrado de proteínas de carga selecionadas para a rede trans-Golgi (TGN) em tempo real.
Geramos uma coleção de nanocorpos anti-GFP funcionalizados distintos compartilhando uma arquitetura modular comum, usando técnicas padrão de clonagem molecular17. Embora o estudo atual se concentre na variante fluorescente VHH-mCherry, também incluímos nanocorpos derivatizados adicionais para ilustrar a versatilidade desse conjunto de ferramentas e destacar seu potencial para aplicações futuras. Nossa construção mais básica, VHH-std (std para padrão), compreende o domínio VHH, epítopos T7 e HA para detecção baseada em anticorpos, uma marca de hexa-histidina C-terminal (His6) para purificação e uma sequência de peptídeo aceptor de biotina (BAP) para permitir a biotinilação enzimática e ensaios pulldown baseados em estreptavidina de alta afinidade (Figura 1A). A partir desse projeto central, vários derivados de nanocorpos foram desenvolvidos para facilitar o estudo do tráfego endocítico e retrógrado por meio de análises bioquímicas, imagens de células fixas e vivas e microscopia eletrônica.
Para imagens de células vivas do transporte endocítico, projetamos um nanocorpo fluorescente anti-GFP incorporando um fluoróforo com espectros de excitação e emissão distintos dos da GFP, garantindo assim a separação espectral ideal durante a microscopia de fluorescência. Com base em suas propriedades superiores de dobramento em E. coli induzida por IPTG e suas propriedades fotofísicas bem caracterizadas, selecionamos mCherry como a marca fluorescente de escolha. Outros fluoróforos com desvio para o vermelho, como a proteína fluorescente vermelha monomérica (mRFP), também seriam alternativas adequadas em princípio, mas o mCherry provou ser particularmente robusto e eficaz neste sistema.
Qual é o potencial de outros nanocorpos funcionalizados além do VHH-mCherry? Para investigar o tráfego de proteínas da membrana plasmática para a rede trans-Golgi (TGN), aproveitamos a localização específica do compartimento de TPSTs, que residem exclusivamente nas cisternas TGN e trans-Golgi. Para isso, modificamos o VHH-std com um motivo de sulfatação de tirosina em tandem (2xTS) derivado da proccolecistocinina29 de rato, permitindo assim uma leitura bioquímica da chegada da carga a esses compartimentos. Enquanto a fusão de VHH-std com mCherry permite a visualização direta do transporte retrógrado por imagens fixas ou de células vivas, a funcionalização com peroxidases como APEX230 permite a localização ultraestrutural por microscopia eletrônica, ablação citoquímica direcionada ou ensaios de biotinilação baseados em proximidade. Além disso, a incorporação de um local de clivagem da protease do vírus gravura em àgua forte do tabaco (TEV) no andaime do nanobody fornece meios bioquímicos distinguir entre os nanobodies internalizados e superfície-ligados (Figura 1A). Anteriormente, empregamos a construção VHH-tev para monitorar a cinética de reciclagem de EGFP-CDMPR e TfR-EGFP17 ligados a nanocorpos. O reaparecimento de receptores marcados com nanocorpos na superfície celular pode ser prontamente detectado pela aplicação extracelular, resultando em uma perda específica do de epítopo C-terminal do nanocorpo. Analogamente, a inclusão de um sítio de clivagem TEV dentro do nanocorpo VHH-mCherry funcionalizado com mCherry aqui apresentado permite a avaliação dinâmica da reciclagem de repórteres EGFP por imagens de células vivas. A funcionalização com domínios proteicos alternativos - como fluoróforos adicionais, marcadores enzimáticos ou motivos de sequência para modificação pós-tradução - pode ser prontamente realizada subclonando as inserções desejadas no backbone VHH-std pelos locais de restrição SpeI e EcoRI. Todas as construções de nanocorpos anti-GFP funcionalizadas usadas no estudo original17 foram depositadas com Addgene para distribuição pública.
Usando o protocolo descrito acima, todas as variantes de nanocorpos ilustradas aqui foram purificadas para alto rendimento e pureza (Figura 1B). Apenas a fusão mCherry exibiu um pequeno corte proteolítico dos domínios proteicos após a purificação (Figura 1B, pista 5). Os dois produtos de degradação observados provavelmente correspondem aos domínios individuais VHH e mCherry, conforme inferido de seus pesos moleculares aparentes e verificados pela detecção de immunoblot específico do epítopo (Figura 1C). Na ausência de BirA co-expresso, o VHH-mCherry normalmente se recuperou com rendimentos de aproximadamente 20 mg por preparação. Com base em nossa experiência, a co-expressão de BirA reduz consistentemente o rendimento do nanocorpo em aproximadamente 1/3a 1/2. A biotinilação foi bastante completa porque os nanocorpos de uma mistura 1: 1 com BSA foram totalmente recuperados por estreptavidina-agarose ( Figura 1D ).
Para avaliar a adequação deste kit de ferramentas de nanocorpos para estudar o transporte endocítico, geramos linhas celulares HeLa estáveis expressando proteínas receptoras de superfície marcadas com EGFP com rotas distintas de tráfego intracelular. Estes incluíram TfR, que alterna entre a membrana plasmática e os endossomos iniciais (triagem e reciclagem); TGN46, que trafega entre a membrana plasmática e o TGN por endossomos iniciais; e ambos os MPRs, que transitam entre o TGN, a membrana plasmática e os endossomos precoce e tardio17. O EGFP foi fundido ao domínio extracelular de cada receptor - especificamente, inserido entre o peptídeo sinal e a sequência do receptor para CDMPR, CIMPR e TGN46 - e ao terminal C de TfR. Este projeto preservou os domínios citoplasmáticos nativos, garantindo que todos os sinais de classificação conhecidos permanecessem intactos e a etiqueta EGFP acessível para ligação por nanocorpos anti-GFP extracelulares (Figura 1E). Para o CIMPR, cujo domínio extracelular é incomumente grande, foi utilizada uma versão truncada, consistente com estudos anteriores que demonstraram que tal truncamento preserva o comportamento normal de tráfego31,32.
Linhagens celulares estáveis foram estabelecidas por transdução retroviral, seguida de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para isolar populações de células homogêneas com níveis de expressão moderados e comparáveis. Digno de nota, EGFP-CDMPR apareceu consistentemente como uma banda dupla em immunoblots, semelhante à sua contraparte endógena33, indicativa de glicosilação heterogênea. Para avaliar se as proteínas de fusão EGFP recapitulam os padrões de localização e expressão em estado estacionário das proteínas endógenas, as células que expressam de forma estável foram co-cultivadas com células HeLa parentais e analisadas por microscopia de fluorescência confocal (Figura 2B). O sinal EGFP refletiu fielmente a distribuição das proteínas endógenas correspondentes. Como esperado, CDMPR, CIMPR e suas versões marcadas com EGFP localizaram-se predominantemente na região perinuclear - refletindo TGN e compartimentos endossômicos tardios - com marcação adicional em endossomos periféricos. Tanto o TGN46 endógeno quanto o marcado com EGFP foram encontrados quase exclusivamente no TGN perinuclear, enquanto o TfR e o TfR-EGFP exibiram a distribuição endossômica inicial característica, com triagem periférica proeminente e endossomos de reciclagem perinuclear. Embora os anticorpos usados tenham detectado as formas endógena e marcada com EGFP (exceto CIMPR), a intensidade geral da coloração não foi acentuadamente aumentada nas células que expressam as proteínas de fusão, sugerindo que as construções EGFP não foram substancialmente superexpressas. Incluímos EGFP-TGN46 e EGFP-CIMPR na Figura 2B para comparação direta com EGFP-CDMPR e TfR-EGFP. Os protocolos utilizados para fixação celular e microscopia de fluorescência estão descritos em estudos anteriores17,19.
Usando VHH-mCherry, o transporte endocítico de proteínas repórter marcadas com EGFP pode ser monitorado por imagens de células vivas. Para isso, utilizamos como exemplos células expressando EGFP-CDMPR e TfR-EGFP. As células foram fotografadas ao longo do tempo com um microscópio fluorescente de campo amplo invertido após a adição de VHH-mCherry ao meio (Vídeo 1 e Vídeo 2). Imagens estáticas em vários pontos de tempo são mostradas na Figura 3. A captação foi quantificada medindo o sinal no canal mCherry, subtraindo o fundo de autofluorescência e normalizando para o sinal EGFP para eliminar flutuações devido ao movimento de compartimentos marcados ou possíveis pequenos deslocamentos no plano focal. A fluorescência de VHH-mCherry no meio a 25 nM foi insignificante e não interferiu nas medidas. A análise do transporte dos repórteres da superfície celular para seus compartimentos intracelulares, para a distribuição em estado estacionário, produziu os mesmos resultados cinéticos que os experimentos bioquímicos mostrados na Figura 2 da publicação anterior17, com meias-vidas aparentes de captação de ~ 9 min para EGFP-CDMPR e ~ 4 min para TfR-EGFP, e saturação após ~ 43 min e ~ 20 min, respectivamente. Esses valores foram comparáveis aos valores obtidos em experimentos de captação bioquímica usando ensaios de immunoblotting17. Em princípio, a cinética do transporte retrógrado para regiões subcelulares de interesse, como a região perinuclear de maior concentração de MPRs, também pode ser analisada. No entanto, a região perinuclear contém não apenas Golgi / TGN, mas também é enriquecida em endossomas tardios e endossomos de reciclagem. A cinética de absorção de nanocorpos na região perinuclear não é suficientemente específica para analisar o transporte retrógrado para uma organela definida. Para avaliar de forma mais confiável o transporte da membrana plasmática para o TGN, outra proteína fluorescente, uma proteína transmembrana residente no TGN, deve ser co-expressa de forma estável junto com a proteína repórter GFP, de forma que não haja sobreposição espectral das propriedades do fluoróforo. O uso desse marcador extra permite a detecção de VHH-mCherry importado por repórter, análogo à sulfatação de tirosina mediada por TPSTs, conforme documentado anteriormente19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig1.jpg"> 
Figura 1: Projeto e produção de nanocorpos derivatizados para rastrear proteínas de superfície celular marcadas com EGFP. (A) Visão geral esquemática dos nanocorpos derivatizados. A construção padrão de nanocorpos compreende um domínio VHH específico para GFP, etiquetas de epítopos T7 e HA, um peptídeo aceitador de biotina (BAP) e uma marca de hexahistidina C-terminal (His6) para purificação. Variantes adicionais de nanocorpos incluem modificações com locais de sulfatação de tirosina em tandem (2xTS), a peroxidase projetada APEX2 ou a proteína fluorescente mCherry. A barra de escala indica o comprimento do aminoácido (aa). (B) Nanocorpos expressos por bactérias e purificados por afinidade (20-50 μg) foram analisados por gradiente SDS-PAGE e visualizados pela coloração de Coomassie. Os padrões de peso molecular (em kDa) são indicados à esquerda. Clipagem proteolítica menor foi observada apenas para VHH-mCherry, provavelmente ocorrendo entre os domínios VHH e mCherry. (C) Análise imunoblot de preparações de nanocorpos (10 ng) usando anticorpos direcionados contra epítopos T7, HA ou His6 , ou detectados por estreptavidina-HRP (SA-HRP) para avaliação da biotinilação. (D) A extensão da biotinilação de nanocorpos foi avaliada pela incubação de nanocorpos na proporção de 1:1 com BSA, seguida de pulldown de estreptavidina-agarose, peletização e lavagem das contas. Volumes iguais do sobrenadante (S) e do material ligado ao cordão (B) foram posteriormente analisados por SDS-PAGE e coloração de Coomassie. A recuperação quantitativa do nanocorpo na fração ligada ao grânulo indica biotinilação completa. A presença de fragmentos de VHH e mCherry na fração ligada sugere degradação parcial, provavelmente ocorrendo durante a preparação da amostra para análise SDS-PAGE. A linha branca entre as pistas 2 e 3 indica a exclusão de duas faixas não relacionadas. Este número foi modificado de17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig2.jpg"> 
Figura 2: Expressão e localização intracelular de receptores de carga marcados com EGFP marcados com fluorescência. (A) Representação esquemática das construções de fusão EGFP. As sequências derivadas de proteínas transmembranares secretoras são representadas em preto, com peptídeos sinal N-terminais e domínios transmembranares internos destacados em amarelo. A metade EGFP é ilustrada em verde. Construtos completos foram gerados para CDMPR, TfR e TGN46, enquanto uma variante truncada bem caracterizada foi usada para CIMPR para preservar o comportamento normal de tráfego. A barra de escala indica o comprimento do aminoácido (aa). EGFP-CDMPR e TfR-EGFP foram descritos anteriormente17. (B) Para avaliar a localização subcelular, as células HeLa que expressam de forma estável as proteínas de fusão EGFP foram co-cultivadas com células HeLa parentais e analisadas por microscopia de fluorescência. A barra de escala representa 10 μm. (C) As células HeLa que expressam de forma estável as proteínas repórteres marcadas com EGFP foram lisadas e os extratos de proteínas foram submetidos a SDS-PAGE seguido de immunoblotting usando anticorpos contra GFP e actina. Os marcadores de peso molecular (em kDa) são indicados à direita. Este número foi modificado de17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig3.jpg"> 
Figura 3: Imagem de células vivas da cinética de captação endocítica de nanocorpos mediada por EGFP-CDMPR e TfR-EGFP. A imagem de células vivas foi realizada após a adição de 25 nM VHH-mCherry às células HeLa expressando de forma estável (A) EGFP-CDMPR ou (B) TfR-EGFP em meio completo sem vermelho de fenol a 37 ° C. As células foram fotografadas nos canais GFP e mCherry usando um microscópio de fluorescência de campo amplo semiautomatizado em intervalos de 36 s. Imagens estáticas mescladas representativas são mostradas, acompanhadas por visualizações ampliadas da região perinuclear (ampliação: 2,2x) em canais individuais abaixo. (Barras de escala, 10 μm.) Veja também o Vídeo 1 e o Vídeo 2. A análise quantitativa da cinética de absorção de nanocorpos em (C) EGFP-CDMPR e (D) TfR-EGFP foi realizada usando dados de três experimentos independentes, cada um capturando aproximadamente 40 células individuais. Para levar em conta o movimento da organela e a variabilidade do plano focal, a intensidade de fluorescência mCherry foi normalizada (norma) para o sinal GFP e plotada como a média ± DP em todas as células dos três experimentos. O sinal de captação máxima média foi normalizado para 1. A cinética de captação para cada célula foi ajustada individualmente usando um modelo cinético de primeira ordem. As linhas plotadas representam as curvas médias derivadas da média das constantes de taxa correspondentes. Este número foi modificado de17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo 1: Imagem de células vivas da captação de nanocorpos mCherry por EGFP-CDMPR. As células HeLa expressando EGFP-CDMPR de forma estável foram incubadas a 37 ° C em meio completo contendo 25 nM VHH-mCherry e fotografadas nos canais de fluorescência EGFP e mCherry em intervalos de 36 s. O filme foi renderizado a uma taxa de reprodução de 5 quadros/s, correspondendo a uma compactação em tempo real de 3 min/s. Este filme foi modificado de17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/MOVIE%201.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 2: Imagem de células vivas da captação de nanocorpos mCherry por TfR-EGFP. As células HeLa que expressam TfR-EGFP de forma estável foram incubadas a 37 ° C em meio completo suplementado com 25 nM VHH-mCherry e imageadas para fluorescência de EGFP e mCherry em intervalos de 36 s. O filme foi renderizado a 5 quadros/s, representando uma taxa de lapso de tempo de 3 min/s. Este filme foi modificado de17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/MOVIE%202.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>

Imagem de células vivas do transporte endocítico usando nanocorpos funcionalizados em células cultivadas

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