Engenharia Epigenética de Células K562: Estratégia Episómica de Vetor Duplo para Metilação de DNA Direcionada Estável usando Proteínas de Fusão dCas9-DNMT3A e -HDAC1

Nossa pesquisa visa desenvolver um sistema estável e não integrado para metilação direcionada do DNA, explorando a edição epigenética durável em células K562. Avanços recentes na área incluem sistemas CRISPR-dCas9 com efetor duplo, combinando enzimas epigenéticas para modificação epigenética sinérgica, estável e específica localmente. Para começar, mantenha as células K562 em frascos de cultura T75 a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e condições umidificadas.

Quantifique o DNA epissomal a ser usado para transfecção usando um espectrofotômetro a 260 nanômetros. Use oito microgramas de DNA total do plasmídeo por transfecção preparando quatro microgramas de cada plasmídeo para uma co-transfecção, e misture a quantidade necessária com 90 microlitros de água ultrapura. Agora, adicione 10 microlitros de solução de acetato de sódio 3 molares e 2,5 volumes de etanol 100% à solução de DNA diluído.

Misture a solução de DNA cuidadosamente e incube-a durante a noite a 20 graus Celsius para permitir a precipitação do DNA. No dia seguinte, centrifuge o tubo de precipitação de DNA a 11.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em condições estéreis, em um armário de biossegurança, descarte cuidadosamente o sobrenadante do tubo.

Adicione 500 microlitros de etanol a 70% ao tubo para lavar o pellet, e centrifuge novamente a 11.000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova completamente o sobrenadante de etanol do tubo e deixe a pastilha de DNA secar ao ar até que não reste etanol visível. Depois, ressuspenda completamente o pellet de DNA seco em 50 microlitros de DMEM.

Mantenha 400 nanogramas do DNA ressuspenso em aproximadamente 2,5 microlitros em um novo tubo e armazene a solução plasmídica de DMEM a quatro graus Celsius até novo uso. Analise a amostra restante de DNA em um gel de 1%agarose para verificar a purificação e integridade do DNA. Colhe células de K562 de um frasco T75 quando as culturas atingirem 50 a 60% de confluência para garantir a eficiência ótima da transfecção.

Conte as células colhidas usando um hemocitômetro e transfira um volume contendo duas vezes 10 para a potência de cinco células para um recipiente de cultura de 35 milímetros contendo 900 microlitros de DMEM sem FBS ou antibióticos. Coloque o recipiente de cultura em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para manter as células prontas para transfecção. Use um kit de transfecção à base de lipofectamina para administrar plasmídeos seguindo as instruções do fabricante e ajustando os volumes se necessário.

Adicione três microlitros do reagente P3000 à solução plasmídica DMEM previamente preparada. Misture delicadamente e incube a mistura em temperatura ambiente por cinco minutos. Agora, adicione cinco microlitros do reagente Lipofectamina 3000 junto com DMEM suficiente para atingir um volume final de 100 microlitros.

Incube essa mistura de transfecção em temperatura ambiente por 15 minutos. Adicione os 100 microlitros completos da mistura de transfecção ao recipiente de cultura de 35 milímetros contendo as células. Agite o prato suavemente para dispersar a mistura de forma uniforme e depois o coloque na incubadora.

Às 24 horas após a transfecção, adicione três mililitros de DMEM do meio completo suplementado com 10% de FBS e uma vez penicilina estreptomicina a cada recipiente para promover a proliferação das células transfectadas. Às 72 horas após a transfecção, comece a seleção adicionando o antibiótico G418 para atingir a concentração final de um miligrama por mililitro. Uma vez estabelecido o processo de seleção e a quantidade total de células exceder um vezes 10 elevados à potência de seis, colhe-se as células por centrifugação a 300 G por seis minutos a 25 graus Celsius.

Lave o pellet uma vez com PBS estéril único, pH aproximadamente 7,4, e centrifuge novamente nas mesmas condições. Após ressuspender o pellet celular final em PBS uma vez, determine a concentração celular usando um hemocitômetro. Dilua a suspensão para um vezes 10 para a potência de seis células por mililitro, garantindo que as células estejam totalmente ressuspensas, e transfira as células para um tubo de citometria de fluxo.

Em seguida, configure o classificador de células ativado por fluorescência para modo de célula única usando uma placa tratada com cultura de tecido de 96 poços como dispositivo de coleta. Ajuste as configurações do software dependendo do instrumento utilizado. Limite a população primária selecionando células com base na dispersão direta e lateral para isolar o tamanho e a granularidade esperados.

Exclua detritos e células altamente granulares ou mortas, e use área de dispersão frontal versus altura ou área de dispersão lateral versus plots de altura para singlets de porta. Depois, preencha cada poço da placa de 96 poços com 100 microlitros de meio completo contendo um miligrama por mililitro de G418, e aqueça a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius. Realize a separação de células no modo de célula única, mantendo a taxa de ordenação abaixo de 300 eventos por segundo para melhorar a precisão.

Após a separação, inspecione cada poço ao microscópio para confirmar a presença de uma única célula por poço e coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Permita que os clones de célula única se expandam individualmente na placa de 96 poços. Uma vez que o crescimento clonal seja evidente, adicione meio contendo G418 reduzido aos poços até uma concentração final de 400 microgramas por mililitro para manter a pressão seletiva.

Transfira clones em crescimento bem sequencial para placas de 12 poços, depois para frascos T25 e, finalmente, para frascos T75 conforme necessário, até que cada clone atinja aproximadamente um vezes 10 para a potência de seis células. Em seguida, colete pellets de célula dupla em intervalos regulares. Armazene um pellet a menos 20 graus Celsius para extração genômica de DNA.

Homogeneize um segundo pellet em 500 microlitros de reagente TRIzol e armazene-o a menos 20 graus Celsius para extração de RNA e síntese complementar de DNA. Extraia DNA genômico de clones selecionados usando extração de fenol-clorofórmio seguida de precipitação com etanol. Ressuspenda completamente o DNA extraído em água sem nuclease ou em um tampão TE.

Meça a concentração e pureza do DNA usando um espectrofotômetro antes de continuar para as etapas a jusante. Por fim, extraia o RNA total dos pellets celulares armazenados usando reagente TRIzol, seguido pela precipitação de isopropanol. Células individuais foram separadas em placas de 96 poços usando separação celular ativada por fluorescência para isolar aquelas que carregam ambos os construtos.

A análise PCR de 10 clones expandidos confirmou que apenas alguns mantiveram ambos os construtos, indicados por bandas em 230 pares de bases e 205 pares de bases. A pirosequenciação revelou que o clone positivo dois apresentou aumento na metilação em múltiplos sítios de CPG próximos à região alvo do gRNA1 em comparação com o controle não transfectado. Abordamos a falta de sistemas de entrega de longo prazo não integrados, permitindo uma edição epigenética precisa e estável sem alterar o genoma do hospedeiro.

Nossos achados estabelecem uma ferramenta confiável para estudar a regulação gênica por meio da metilação alvo e apoiam o desenvolvimento de possíveis terapias epigenéticas precisas. Pesquisas futuras explorarão a melhoria da entrega epissomal, a minimização dos efeitos-alvo, o aprimoramento com a eficiência do Cas9 e a adaptação do sistema para modelos primários ou in vivo.