Name: Geração Eficiente e Rápida de Células Assassinas Induzidas por CAR-T e Citocinas em Dispositivos Escaláveis por GMP (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a expandir células CAR-T e CIK de forma escalável usando dispositivos G-Rex em conformidade com GMP. Este protocolo garante alta viabilidade e funcionalidade citotóxica para aplicações clínicas em imunoterapia oncológica.

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<ol><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+as+personalized+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.</a> Science. 348 (6230), 62-68 (2015).</li>
<li>Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">NK cells for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).</li>
<li>Cappuzzello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+cytokine-induced+killer+cells+overcome+CAR-T+cell+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">How can cytokine-induced killer cells overcome CAR-T cell limits.</a> Front Immunol. 14, 1229540(2023).</li>
<li>Sharma, A., Schmidt-Wolf, I. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((30+years+of+CIK+cell+therapy%3A+Recapitulating+the+key+breakthroughs+and+future+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">30 years of CIK cell therapy: Recapitulating the key breakthroughs and future perspective.</a> J Exp Clin Cancer Res. 40, 388(2021).</li>
<li>Bayatipoor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NKT+cells+in+cancer+immunotherapy-from+bench+to+bed%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Role of NKT cells in cancer immunotherapy-from bench to bed.</a> Med Oncol. 40, 29(2022).</li>
<li>Hayday, A., Dechanet-Merville, J., Rossjohn, J., Silva-Santos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+by+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy by γδ T cells.</a> Science. 386, 6717(2024).</li>
<li>Rohaan, M. W., van den Berg, J. H., Kvistborg, P., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+melanoma%3A+A+viable+treatment+option%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: A viable treatment option.</a> J Immunother Cancer. 6, 102(2018).</li>
<li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li>
<li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cells%3A+The+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineered T cells: The promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 16, 566-581 (2016).</li>
<li>Zhang, J., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+world+of+TCR-T+cell+trials+against+cancer%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">The emerging world of TCR-T cell trials against cancer: A systematic review.</a> Technol Cancer Res Treat. 18, 1533033819831068(2019).</li>
<li>Sadelain, M., Brentjens, R., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+principles+of+chimeric+antigen+receptor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">The basic principles of chimeric antigen receptor design.</a> Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).</li>
<li>Cappuzzello, E., Sommaggio, R., Zanovello, P., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+for+the+induction+of+antitumor+effectors%3A+The+paradigm+of+cytokine-induced+killer+%28CIK%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of cytokine-induced killer (CIK) cells.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 36, 99-105 (2017).</li>
<li>Palmerini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-free+protocol+for+the+ex+vivo+expansion+of+cytokine-induced+killer+cells+using+gas-permeable+static+culture+flasks%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks.</a> Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).</li>
<li>Pietà, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+therapeutic+strategy+for+B-cell+malignancies+that+combines+obinutuzumab+and+cytokine-induced+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Innovative therapeutic strategy for B-cell malignancies that combines obinutuzumab and cytokine-induced killer cells.</a> J Immunother Cancer. 9, e002475(2021).</li>
<li>Pievani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+capability+of+CD3%2BCD56%2B+CIK+cells%2C+a+T-cell+subset+that+acquires+NK+function+and+retains+TCR-mediated+specific+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity.</a> Blood. 118 (12), 3301-3310 (2011).</li>
<li>Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retargeting+cytokine-induced+killer+cell+activity+by+CD16+engagement+with+clinical-grade+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies.</a> OncoImmunology. 5, e1199311(2016).</li>
<li>Rambaldi, B., Rizzuto, G., Rambaldi, A., Introna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+and+unmodified+cellular+approaches+to+enhance+graft+versus+leukemia+effect%2C+without+increasing+graft+versus+host+disease%3A+The+use+of+allogeneic+cytokine-induced+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetically modified and unmodified cellular approaches to enhance graft versus leukemia effect, without increasing graft versus host disease: The use of allogeneic cytokine-induced killer cells.</a> Front Immunol. 15, 1459175(2024).</li>
<li>Rotte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+correlation+for+CAR-T+cells%3A+A+systematic+review+of+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies.</a> J Immunother Cancer. 10, e005678(2022).</li>
<li>Zhang, Y., Schmidt-Wolf, I. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-year+update+of+the+international+registry+on+cytokine-induced+killer+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ten-year update of the international registry on cytokine-induced killer cells in cancer immunotherapy.</a> J Cell Physiol. 235 (12), 9291-9303 (2020).</li>
<li>Garcia-Aponte, O. F., Herwig, C., Kozma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+expansion+in+bioreactors%3A+Upgrading+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte expansion in bioreactors: Upgrading adoptive cell therapy.</a> J Biol Eng. 15, 13(2021).</li>
<li>Smith, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+expansion+in+a+Xuri+Cell+Expansion+System+W25%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell expansion in a Xuri Cell Expansion System W25.</a> Methods Mol Biol. 2086, 151-163 (2020).</li>
<li>Ludwig, J., Hirschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+process+optimization+for+large-scale+CAR+T+expansion+using+the+G-Rex+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods and process optimization for large-scale CAR T expansion using the G-Rex cell culture platform.</a> Methods Mol Biol. 2086, 165-177 (2020).</li>
<li>Vera, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J Immunother. 33, 305-315 (2010).</li>
<li>Bajgain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+production+of+suspension+cells+using+the+G-Rex+%26%2334%3BM%26%2334%3B+series%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex &#34;M&#34; series.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14015(2014).</li>
<li>Talleur, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+CD27-depleted+cells+in+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cell+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Allogeneic CD27-depleted cells in adoptive cell therapy.</a> Adv Cell Gene Ther. 2, e45(2019).</li>
<li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+HER2%2Fneu-specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr-51+release+assay+to+the+xCELLigence+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system.</a> J Vis Exp. (66), e3683(2012).</li>
<li>Eberhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+serum-free+media+on+the+expansion+and+functionality+of+CD19.CAR+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells.</a> Int J Mol Med. 52, 58(2023).</li>
<li>Cadiñanos-Garai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+temporal+mapping+of+CAR+T+cells+reveals+phenotypic+and+functional+remodeling+during+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing.</a> Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).</li>
<li>Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+process+development+of+NK+and+CAR-NK+expansion+in+a+closed+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor.</a> Front Immunol. 15, 1412378(2024).</li>
<li>Noldner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lung+cancer+tumor-infiltrating+lymphocyte+%28TIL%29+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing.</a> Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).</li>
<li>Bandeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+processing+of+lentiviral+vectors%3A+Releasing+bottlenecks%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).</li>
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A terapia celular adotiva (ACT) tornou-se um pilar importante das terapias avançadas para o tratamento do câncer. Essa abordagem é baseada na administração ex vivo de produtos celulares expandidos para alcançar eficácia antitumoral1. Até o momento, muitos tipos celulares foram usados no ACT, variando desde abordagens antigênicos-específicas, por exemplo, natural killer (NK)2, assassino induzido por citocinas (CIK)3,4, natural killer T (NKT)5 ou células Tγδ 6, até células altamente específicas e personalizadas, como linfócitos infiltradores de tumores (TILs)7 e terapias celulares engenheiradas, por exemplo, receptor de antígeno quimérico (CAR)1. 8 e células receptoras de células T (TCR) 9,10.
As células CAR-T são células T geneticamente modificadas geradas por transdução viral ex vivo para expressar um receptor imunológico sintético projetado para reconhecer um alvo molecular específico. A estrutura CAR consiste em um anticorpo Fragmento variável de cadeia única (scFv) específico para antígeno, combinado com domínios de sinalização intracelular, incluindo a cadeia TCRζ e moléculas coestimuladoras. Após o engajamento do antígeno, o domínio intracelular fornece sinais de ativação que promovem a proliferação das células T e a atividadeantitumoral 11.
As células CIK são uma população heterogênea de linfócitos T ativados que adquirem expressão de CD56 durante a expansão ex vivo a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou do sangue do cordão umbilical (UCB)12. Essa expansão envolve estimulação com Interferon-γ (IFN-γ), anticorpo monoclonal anti-CD3 e Interleucina-2 (IL-2), seguida de cultura em IL-2 por 14 dias. As células CIK funcionalmente se assemelham tanto às células NK quanto às células T, exercendo atividade antitumoral por meio de mecanismos independentes e dependentes do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e dependentes 13,14,15,16. Essas propriedades permitem que as células CIK sejam usadas tanto em ambientes terapêuticos alogênicos quanto autólogos, com risco mínimo de doença enxerto-versus-hospedeiro (GvHD) 17.
Na prática clínica, tanto as terapias celulares CAR-T quanto CIK exigem a administração de grandes quantidades de células. As células CAR-T são infundidas em 50 a 200 milhões de doses porpaciente 18. De forma semelhante, as células CIK são tipicamente administradas em doses de até 10 bilhões de células por infusão, com pacientes frequentemente recebendo múltiplas infusões dependendo do protocolode tratamento 19. Métodos tradicionais de cultura celular usando frascos ou placas são ineficientes, demorados e exigem passagem frequente, tornando a expansão em larga escala inviável e aumentando o risco de contaminação. Sistemas automatizados ou semi-automatizados usando culturas em sacos ou biorreatores permitem expansão em larga escala, mas apresentam limitações, ou seja, tensão de cisalhamento ou necessidade de ajustes de densidade e perfusão frequente de meio20,21, além do manuseio de um lote por vez, levando a altos custos tanto em contextos acadêmicos quanto industriais. Nessa situação desafiadora, uma alternativa é representada pelo dispositivo de expansão rápida permeável a gases (G-Rex), um método de cultura estática com membrana de silício no fundo do poço, que garante uma troca eficiente de oxigênio e maior altura dos vasos, permitindo a capacidade de médios de alto volume. Assim, o sistema suporta o crescimento celular sem substituição do meio ou ajustede densidade 22,23. Os sistemas G-Rex-M demonstraram escalabilidade de até 5000 mL e são compatíveis com sistemas automatizados de colheita, fornecendo uma plataforma de cultura fechada e livre de contaminação, facilmente transferível de ambientes acadêmicos para clínicos para o desenvolvimento de produtos medicinais de terapia avançada (ATMPs)24.
No procedimento descrito, aproveitamos as vantagens e características dos dispositivos G-Rex para otimizar o protocolo de expansão tanto das células CAR-T quanto CIK. Demonstramos que ambos os tipos celulares podem ser expandidos e ampliados de forma eficiente, mantendo um fenótipo e perfil funcional consistentes entre diferentes sistemas de cultura. Uma visão geral esquemática do protocolo de expansão tanto para células CIK quanto CAR-T é mostrada na Figura 1.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Visão geral dos protocolos de expansão celular CAR-T e CIK usando dispositivos de cultura G-24 ou G-6M. As células CAR-T e CIK são expandidas a partir de PBMCs isolados a partir do Dia 0. Para a expansão das células CAR-T, as PBMCs são estimuladas no dia 1 com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, geneticamente modificadas no dia 2 e, posteriormente, cultivadas com suplementação de hIL-7 e hIL-15 a cada 3-4 dias, com colheita final para ensaios funcionais no dia 9. No formato G-6M, a suplementação com citocinas é limitada ao segundo dia, sem necessidade de alimentação adicional de citocinas durante todo o período de cultivo. Para a expansão das células CIK, as PBMCs são estimuladas no dia 1 com rhIFN-γ e no dia 2 com anticorpos anti-CD3 e rhIL-2, que são então administradas a cada 3-4 dias. No G-24, uma mudança de médio é necessária simultaneamente com o suplemento de citocinas. As células CIK são coletadas no Dia 14 para ensaios funcionais posteriores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Brilhante Amortecedor de Mancha</td><td>BD em Biociências</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD28, anti-humano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-375</td><td>Clone 15E8</td></tr><tr><td>Anticorpo CD3, anti-humano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-387</td><td>Clone OKT3</td></tr><tr><td>CD3 BV510</td><td>BD em Biociências</td><td>740147</td><td>Clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD314 APC (NKG2D)</td><td>Biolenda</td><td>320808</td><td>Clone 1D11</td></tr><tr><td>CD4 BV650</td><td>BD em Biociências</td><td>563875</td><td>Clone SK3</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP-Cy5.5</td><td>BD em Biociências</td><td>563429</td><td>Clone HI100</td></tr><tr><td>CD56 PE</td><td>Biolenda</td><td>318306</td><td>Clone HCD56</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD em Biociências</td><td>555543</td><td>Clone FREG-56</td></tr><tr><td>CD8 BV450</td><td>BD em Biociências</td><td>562428</td><td>Clone RPA-T8</td></tr><tr><td>Kit de Proliferação de Células Violetas CellTrace</td><td>ThermoFisher científico</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO)</td><td>ThermoFisher científico</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco & prime; s Soro Tamponado com Fosfato (D-PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>E-plate 16</td><td>Agilent</td><td>5469813001</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (FBS), Valor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Stain Viability Fixável 780 (FVS780)</td><td>BD em Biociências</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 Poços do G-Rex&nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80192M</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Poço G-Rex 6M &nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80660M</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Buffer HEPES</td><td>Lonza</td><td>ECM0180D</td><td></td></tr><tr><td>Seu Anticorpo</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-120-718</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Humana 20%</td><td>CSL Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteína Recombinante IL-15 Humana</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Proteína recombinante IL-7 humana</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20</td><td>BD em Biociências</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Tecnologias STEMCELL</td><td>18060</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Linha celular de câncer de mama &nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina</td><td>Lonza</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Solução fisiológica (0,9% de cloreto de sódio)</td><td>Monico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Protamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3369</td><td></td></tr><tr><td>Raji</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Linha celular de linfoma de Burkitt &nbsp;</td></tr><tr><td>IFN-gama humana recombinante</td><td>R& Sistemas D</td><td>285-SE-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 recombinante (Proleucina)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rhCD19-Ele</td><td>Invitrogen</td><td>A42607</td><td></td></tr><tr><td>Instituto Memorial Roswell Park 1640 (RPMI-1640)</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina Estável</td><td>Lonza</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>Solução Trypan-Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Análise de Células em Tempo Real xCELLigence</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio Celular Hematopoiético Livre de Soro X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>02-053Q</td><td></td></tr></tbody></table>

geração eficiente e rápida de células assassinas induzidas por car-t e citocinas em dispositivos escaláveis por gmp

Efficient and Rapid Generation of CAR-T and Cytokine-Induced Killer Cells in GMP-scalable Devices

O protocolo descrito aqui fornece um fluxo de trabalho eficiente e robusto para a expansão e engenharia ex vivo de células efetoras a partir de PBMCs isoladas, nomeadamente células CAR-T e CIK. Esse método requer manipulação celular mínima e aproveita a capacidade de troca gasosa dos dispositivos G-Rex, proporcionando uma disponibilidade de nutrientes e oxigenação superiores em comparação com sistemas convencionais de cultura estática23,24. Uma vantagem chave deste protocolo é sua escalabilidade inerente, desde dispositivos de pequena escala de 24 poços (G-24), adequados para estudos pré-clínicos, até dispositivos maiores de 6M (G-6M), compatíveis com necessidades de fabricação translacional ou clínica, sem exigir alterações no protocolo além da escalonamento proporcional.
Usando esse protocolo, tanto as células CAR-T quanto CIK foram expandidas com sucesso em paralelo a partir de PBMCs doadores saudáveis nos formatos G-24 e G-6M, conforme descrito nas Seções 2-4. Ao final do período de cultivo, ambos os tipos celulares apresentaram alta expansão de dobras e viabilidade, com proliferação comparável entre os dois formatos de dispositivos (Figura 2, Tabela Suplementar 1, Tabela Suplementar 2), destacando a reprodutibilidade do protocolo em diferentes escalas de cultura.
Para validar a escalabilidade dos dispositivos de cultura, células efetoras foram caracterizadas fenotipicamente e funcionalmente. Para as células CAR-T CD19, quantificamos a expressão de CAR e avaliamos os subconjuntos CD4+ e CD8+, observando a predominância das células T CD19 CAR+ CD8+ (Figura 3A-B, Tabela Suplementar 1). Para as células CIK, avaliamos a frequência das populações T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) e CIK (CD3+CD56+) (Figura 3D), bem como a expressão do receptor ativador NKG2D (Figura 3E, Tabela Suplementar 2). Além disso, observamos fenótipos e expressão globalmente comparáveis de marcadores populacionais específicos entre os formatos de cultura G-24 e G-6M tanto para células CAR-T quanto CIK. O status de diferenciação dos produtos celulares CD19 CAR-T e CIK foi analisado por coloração CD62L e CD45RA (Figura 3C-F, Tabela Suplementar 1, Tabela Suplementar 2), revelando fenótipos semelhantes de memória e efetores entre células cultivadas nos formatos G-24 e G-6M. Esses achados demonstram que ampliar o processo não compromete a integridade fenotípica ou o status de diferenciação das populações celulares efetoras expandidas.
Por fim, para avaliar a potência funcional, utilizamos ensaios de citotoxicidade específicos do alvo. Tanto as células CD19 CAR-T quanto CIK expandidas em qualquer um dos dispositivos apresentaram atividade citolítica potente, confirmando a manutenção das propriedades funcionais em toda a escala (Figura 4). No geral, esses resultados apoiam a adequação dos produtos expandidos para aplicações posteriores em modelos pré-clínicos e, potencialmente, para testes clínicos.
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Proliferação e viabilidade das células CAR-T e CIK CD19. As células CAR-T (n = 5) e células CIK (n = 6) expandidas a partir de PBMCs nas placas G-24 e G-6M foram coletadas nos dias 9 e 14 de expansão, respectivamente, para realizar a contagem celular e avaliação do aumento de dobras (A-C) e do percentual (B-D) de células viáveis. Histogramas representam a expressão média ± desvio padrão (DS), e pontos indicam doadores únicos (veja a Tabela Suplementar 1 e a Tabela Suplementar 2 para valores individuais). Os dados foram analisados pelo teste t pareado múltiplo de duas caudas (A-C) ou pelo teste de classificação de pareamento de pareamento de Wilcoxon de duas caudas múltiplas (B-D), com correção de Holm-Sidak para comparações múltiplas (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Avaliação do fenótipo das células CAR-T e CIK CD19 expandida em dispositivos G-24 e G-6M. A expressão das moléculas de CAR em células CAR-T CD19 (n = 5) foi analisada por citometria de fluxo para avaliar (A) a eficiência de transdução nos protocolos de expansão G-24 e G-6M, bem como a expressão de subpopulações (B) CD4+/CD8+ e (C) naïve/memória no subconjunto CD3+CAR+. O fenótipo das células CIK em massa (n = 6) foi analisado por citometria de fluxo para investigar (D) a porcentagem de CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) e T (CD3+CD56-), bem como a expressão de (E) NKG2D e (F) subpopulação naïve/memória no subconjunto CD3+CD56+ (G-24 n=5, G-6M n=6). Naïve (CD45RA+CD62L+), Memória Central (CM, CD45RA-CD62L+), Memória Efetora (EM, CD45RA-CD62L-) e Memória Efetora CD45RA-positiva (EMRA, CD45RA+CD62L-). Histogramas representam a expressão média ± SD, e os pontos indicam doadores únicos (veja a Tabela Suplementar 1 e a Tabela Suplementar 2 para valores individuais). Os dados foram analisados pelo teste t pareado múltiplo de duas caudas (B-C-D-F) ou teste de rank pareado de Wilcoxon de duas caudas (A-E), com correção de Holm-Sidak para comparações múltiplas (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Avaliação da citotoxicidade das células CAR-T e CIK CD19. (A) A lise específica das células CAR-T CD19 (laranja, n = 5) ou das células não transduzidas (UTD) (cinzas, n = 5) contra a linha celular Raji do linfoma de Burkitt (como modelo de linha celular em suspensão) foi realizada por ensaio de morte baseado em citometria de fluxo de 6 horas. Os resultados são mostrados como a lise específica média ± SD. (B) Citotoxicidade das células CIK cultivadas em G-24 (azul claro, n = 7) ou G-6M (azul escuro, n=6) contra a linha celular MCF-7 do câncer de mama (como modelo de linha celular aderente) foi monitorada a cada 15 minutos durante 24 horas usando um analisador celular em tempo real. Os resultados são apresentados como a lise específica média ± SEM. Os dados foram analisados pelo teste de Mann-Whitney, correção de Holm-Sidak para comparações múltiplas (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Estratégia de gating usada para análises de citometria de fluxo. Gráficos representativos ilustrando as estratégias de acesso para (A) a caracterização fenotípica das células CAR-T e (B) células CIK, e (C) o ensaio de citotoxicidade baseado em corantes fluorescentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_Figure%201_RE.pdf" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 1: Crescimento, viabilidade e fenótipo de culturas de células CAR-T CD19 de doadores individuais. Número total de células, aumento de dobra, viabilidade e caracterização fenotípica das células T CD19-CAR colhidas no 9º dia de cultivo em dispositivos G-24 e G-6M são mostrados para cada doador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_1_RE.xlsx" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 2: Crescimento, viabilidade e fenótipo de culturas celulares CIK de doadores individuais. O número total de células, aumento de dobra, viabilidade e caracterização fenotípica das células CIK colhidas no 14º dia de cultivo em dispositivos G-24 e G-6M são mostrados para cada doador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_2_RE.xlsx" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Geração Eficiente e Rápida de Células Assassinas Induzidas por CAR-T e Citocinas em Dispositivos Escaláveis por GMP

Adoptive cell therapies (ACT) have progressed rapidly in recent years, playing a pivotal role in cancer immunotherapy and significantly influencing ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Os efeitos linfodepletivos e imunomoduladores do padrão de tratamento da quimioterapia e radiação podem ser aproveitados para aumentar a eficácia antitumoral da imunoterapia com células T. Descrevemos um método para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas do EGFRvIII e administrá-las no contexto do tratamento padrão de glioblastoma.

Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento

O objetivo deste protocolo é fabricar células T de grau clínico específicas para patógenos usando um dispositivo de enriquecimento celular de segunda geração automatizado de bancada que incorpora um sistema fechado de captura de citocinas e não requer equipe dedicada ou uso de uma instalação GMP. As células T específicas do citomegalovírus pp65 geradas podem ser administradas diretamente aos pacientes.

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