Name: Localização da membrana plasmática e dos receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal usando imagem quantitativa em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda a quantificar a localização de receptores nicotínicos de acetilcolina na membrana plasmática e intracelular em células N2a de mamíferos usando marcadores fluorescentes sensíveis ao pH e microscopia confocal.

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<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1X)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Reagente de descolamento celular</td></tr><tr><td>Alfa-Bungarotoxina Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>B35450</td><td>Conjugado de alfa-bungarotoxina</td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança nível 1 BSL & nbsp;</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Área de trabalho de cultura celular estéril</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9224</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>EMEM com L-glutamina</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Meio celular</td></tr><tr><td>DNA livre de endotoxinas</td><td>Feito internamente usando kits Zymo</td><td>Não aplicável</td><td>DNAs de nAChR para uso em transfecções transitórias celulares</td></tr><tr><td>Tubos microcentrífugas livres de endotoxinas, 0,5 mL&nbsp;</td><td>Aventor/VWR</td><td>89000-010</td><td>DNA e preparação para transfecção</td></tr><tr><td>Tubos microcentrífugas livres de endotoxinas, 1,5 mL&nbsp;</td><td>Aventor/VWR</td><td>20170-038</td><td>DNA e preparação para transfecção</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Aventor/VWR</td><td>97068-085</td><td>Suplemento sérico</td></tr><tr><td>Fluoview FV10i</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td>Microscópio Confocal</td></tr><tr><td>Pratos MatTek com fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>Antenas de imagem</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v. 10</td><td>GraphPad Prisma</td><td>https://www.graphpad.com/features</td><td>Software de análise de dados</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>H3375</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Termociência</td><td>413410025</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>Hidratação MES</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>M5287</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>mTagBFP2-pBAD</td><td>AddGene&nbsp;</td><td>54572</td><td>DNA de controle será usado para transfecção transitória celular &nbsp;</td></tr><tr><td>Células Neuro 2 A (N2a)</td><td>Coleção de Cultura do Tipo Americano</td><td>CCL-131</td><td>Células usadas para transfecções de DNA e expressão de nAChR</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Meio sérico reduzido</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Aventor/VWR</td><td>K952-100mL</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>Bomba de peristalsis</td><td>Gilson</td><td>MiniPuls3</td><td>O buffer muda ao fazer imagens &nbsp;</td></tr><tr><td>Soro salino tamponado com fosfato</td><td>Qualidade Biológico</td><td>119-069-131</td><td>Amortecedor salino</td></tr><tr><td>Auxílio de Pipeta</td><td>Drummond&nbsp;</td><td>140084</td><td>Transferência precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta (estéreis e sem endotoxinas, 1000uL)</td><td>Rainin</td><td>30389216</td><td>Transferência precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta (estéreis e sem endotoxinas, 20uL)</td><td>Rainin</td><td>30389229</td><td>Transferência precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta (estéreis e sem endotoxinas, 250uL)</td><td>Rainin</td><td>30389246</td><td>Transferência precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pipettes, P10</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>L-10XLS</td><td>Transferência precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pipettes, P100</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>L-100XLS</td><td>Transferência precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pipettes, P1000</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>L-1000XLS</td><td>Transferência precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>P3911</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas (estéreis e sem endotoxinas, 10 ML)</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-898</td><td>Transferência precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas (estéreis e livres de endotoxinas, 25 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-900</td><td>Transferência precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (estéreis e sem endotoxinas, 5 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>76201-710</td><td>Transferência precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas (estéreis e sem endotoxinas, 50 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>75816-088</td><td>Transferência precisa de líquidos</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9286</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>Frasco de Cultura de Tecidos</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td>Cultivo de pratos</td></tr><tr><td>Kit de Plasmídeos ZymoPure II Maxiprep</td><td>PESQUISA COM ZYMO</td><td>D4203-A + D4203-B</td><td>Produção de DNA livre de endotoxinas</td></tr><tr><td>&alpha; 4-SEP&nbsp;</td><td>Serviços de Síntese Genética Científica ThermoFisher & nbsp; &nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>Serviços personalizados de síntese gênica</td></tr><tr><td>&alpha; 7-pHuji</td><td>Twist Bioscience</td><td>https://www.twistbioscience.com/</td><td>Serviços personalizados de síntese gênica</td></tr><tr><td>&beta; 2-pHuji</td><td>Serviços de Síntese Genética Científica ThermoFisher & nbsp; &nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>Serviços personalizados de síntese gênica</td></tr></tbody></table>

localização da membrana plasmática e dos receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal usando imagem quantitativa em células de mamíferos

Localization of Plasma Membrane and Intracellular Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors Using Quantitative Imaging in Mammalian Cells

Localização da membrana plasmática e dos receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal usando imagem quantitativa em células de mamíferos

Quantification of neuronal nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) expressed on the plasma membrane of mammalian cells is important for the development ...

localization-plasma-membrane-intracellular-neuronal-nicotinic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Nós desenvolvemos uma nova técnica de quantificar as alterações de receptores de acetilcolina nicotínicos no interior das regiões subcelulares de subtipos específicos de neurónios no SNC a compreender melhor os mecanismos da dependência da nicotina, usando uma combinação de abordagens, incluindo a marcação da proteína fluorescente do receptor usando o arrastamento na abordagem e espectral imagiologia confocal.

Imagem Confocal Espectral de fluorescência com a tag receptores nicotínicos na Knock-em camundongos com a administração de nicotina crônica

Ao marcar os domínios extracelulares dos receptores de membrana com pHluorin superecliptic, e por imagiologia estes receptores de fusão em neurónios de rato em cultura, pode-se visualizar directamente os eventos de inserção individuais vesiculares dos receptores na membrana plasmática. Esta técnica será útil para elucidar os mecanismos moleculares que regulam a inserção do receptor para a membrana plasmática.

Imagiologia pHluorin-tagged Inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas Neurons

Fonte: Zhang, J., et al. Análise Quantitativa de Alta Resolução de Imunoouro de Receptores de Membrana em Sinapses de Fita Retiniana. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra uma técnica de microscopia eletrônica para visualizar a localização do receptor de neurotransmissor nas sinapses da retina. As seções da retina contêm células ganglionares da retina que exibem receptores de neurotransmissores ligados à membrana e são marcadas com a subunidade B da toxina da cólera (CTB). Ao marcar os...

Imagens de alta resolução de receptores de neurotransmissores em sinapses retinianas

Neste trabalho, nós descrevemos um método útil para o estudo ligante fechado função de canal iônico em neurônios de fatias de cérebro de forma aguda isolados. Este método envolve a utilização de uma micropipeta cheia de medicamento para aplicação local de medicamentos para os neurónios gravados utilizando técnicas padrão de fixação de patch.

Aplicação local de Drogas para estudar a função do receptor nicotínico de acetilcolina no cérebro do rato Fatias

Desenvolvemos uma preparação quimérica genética do hipocampo ventral – circuito accumbens in vitro que permite imagens diretas ao vivo para analisar os mecanismos pré-sinápticos da transmissão sináptica mediada pelos receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs). Esta preparação também fornece uma abordagem informativa para estudar os mecanismos pré e pós-sinápticos da plasticidade sináptica.

Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

O método de imunoouro pós-incorporação é uma das maneiras mais eficazes de fornecer análises de alta resolução da localização subcelular de moléculas específicas. Aqui descrevemos um protocolo para analisar quantitativamente os receptores de glutamato nas sinapses da fita retiniana.

High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

Técnicas de microscopia de luz acopladas a ensaios bioquímicos elucidam o envolvimento da exocitose mediada por SNARE na ramificação do axônio dependente de netrina. Essa combinação de técnicas permite a identificação de mecanismos moleculares que controlam a ramificação do axônio e a mudança da forma celular.

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Este artigo apresenta um método para estudar os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) em fatias de cérebro de rato por nicotina uncaging. Quando acoplado com gravação de braçadeira do remendo simultânea e 2-fóton laser, microscopia eletrônica de varredura, nicotina uncaging conecta a função do receptor nicotínico com morfologia celular, proporcionando uma compreensão mais profunda da neurobiologia colinérgico.

Função de receptores nicotínicos de acetilcolina em fatias de cérebro de rato através de Laser Flash fotólise de nicotina Photoactivatable de sondagem

Aqui, descrevemos uma abordagem quantitativa para determinar a distribuição de uma proteína sináptica em relação uma proteína de marcador usando a mancha da imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador.

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Aprenda a quantificar a localização de receptores nicotínicos de acetilcolina na membrana plasmática e intracelular em células N2a de mamíferos usando marcadores fluorescentes sensíveis ao pH e microscopia confocal.

Localização da membrana plasmática e dos receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal usando imagem quantitativa em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal

Localização da membrana plasmática e dos receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal usando imagem quantitativa em células de mamíferos

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