Localização da membrana plasmática e dos receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal usando imagem quantitativa em células de mamíferos

Compreender o tráfego dos receptores nicotínicos de acetilcolina para as membranas plasmáticas dos mamíferos é crucial para investigar a regulação mediada por chaperonas e avaliar terapêuticas seletivas pelo alvo. Uma das principais vantagens das sondas sensíveis ao pH combinadas com microscopia confocal de células vivas é a alta resolução espacial da localização das subunidades. Para começar, pré-aqueça os reagentes a 37 graus Celsius.

Descongele completamente a subunidade nAChR DNase e leve o reagente de transfecção à temperatura ambiente. Limpe todos os reagentes com etanol 70% antes de colocá-los dentro do armário de biossegurança. Para expressar nAChRs alfa-7, em um tubo microcentrífuga, dilua a DNase plasmídico alfa-7 e NACHO em meio sérico reduzido.

Misture suavemente pipetando após a adição de DNA. Alternativamente, para expressar receptores alfa-4 beta-2, dilua 4 microgramas de cada subunidade de DNA em um total de 250 microlitros de meio sérico reduzido e misture suavemente. Ajuste as razões das subunidades para otimizar a expressão de isoformas específicas dos receptores.

Para receptores alfa-4 beta-2 com um plasmídeo adicional, adicione quantidades iguais de cada DNA plasmídeo. Em seguida, em um novo tubo de microcentrífuga, dilua 8 microlitros de reagente de transfecção gota a gota em 250 microlitros de meio sérico reduzido. Após uma incubação de 5 minutos em temperatura ambiente, combine a DNase diluída com o reagente de transfecção diluído gota a gota em um tubo.

Misture suavemente pipetando e incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Enquanto os complexos se formam, substitua o meio nos pratos de cultura por 1 mililitro de EMEM sem soro. Adicione 500 microlitros do complexo de reagentes de transfecção de DNA gota a gota em cada recipiente.

Misture suavemente balançando a placa para distribuir uniformemente, especialmente sobre a superfície inferior do vidro. Incube a placa a 37 graus Celsius por 24 horas e substitua o meio após 4-6 horas. Remova o meio antigo por sucção.

Enxágue o prato três vezes com dois mililitros de PBS por 10 minutos cada em temperatura ambiente. Depois, adicione 2 mililitros de tampão de imagem pH 7,4 ao prato. Insira o prato de imagem no suporte de lâminas de um microscópio confocal e coloque o suporte na câmara ambiental pré-aquecida.

Conecte o tubo da bomba peristáltica ao suporte de placa de imagem e feche a câmara ambiental. Agora, inicie o software de imagem e selecione lasers para os fluoróforos de interesse. Escaneie a antena para localizar células e imagens usando um objetivo de 10-60 x.

Aumente a ampliação se desejar e ajuste a profundidade de foco conforme necessário. Selecione a resolução preferida e capture uma única imagem usando o objetivo desejado. Registre a localização no mapa da antena para realocar as mesmas células após a troca do buffer.

Repita a imagem para várias áreas da antena usando as mesmas configurações de captura para todas as imagens. Mantendo apenas a linha de saída conectada à bomba peristáltica, aspirando lentamente o tampão de pH 7,4 da antena para um recipiente de resíduos. Depois, transfira a linha de entrada para o tampão de têmpera com pH 5,5.

Ligue a bomba peristáltica para adicionar um tampão de pH 5,5 a uma vazão de 1,5 mililitros por minuto, garantindo que as células permaneçam conectadas. Após 20 minutos, desligue a bomba e incube as células do buffer por mais 20 minutos para permitir o equilíbrio. Após a incubação, repita a imagem dos locais salvos.

Para iniciar a quantificação da imagem, abra o ImageJ e carregue a imagem a ser analisada. A imagem aparecerá como uma pilha com cada canal capturado exibido no mesmo quadro. Navegue até o canal de fase.

Se a imagem parecer muito brilhante, selecione Processar e selecione Melhorar Contraste e clique em OK. Use a ferramenta da lupa para dar zoom em uma célula. Use a ferramenta de seleção livre para traçar o contorno da célula no canal de fase. Depois, troque para o canal fluorescente que corresponde ao fluoróforo de interesse.

Defina as medições desejadas selecionando Analisar e clicando em Ajustar Medidas. Certifique-se de que a Área, o valor médio cinza e a densidade integrada estejam verificados. Para medir a região selecionada, escolha Analisar e depois clique em Medir.

Faça três medições de fundo traçando áreas vazias próximas à célula selecionada. Após realizar as medições de todas as células desejadas, copie e cole os dados de medição no Excel para análise. Depois, calcule a média de fundo a partir das três medições de fundo.

Calcule o valor de fluorescência total da célula corrigida ou CTCF para cada célula usando a fórmula fornecida. Usando o mesmo fluxo de trabalho, analise as imagens adquiridas após a troca do buffer. Exporte todos os resultados para um software de análise de dados para processamento estatístico.

Coloração fraca com alfa-BTX AF647 foi observada em células N2a não transfectadas, enquanto marcação robusta de pontos foi detectada em células transfectadas com DNA alfa-7. A quantificação confirmou que a expressão plasmática de nAChRs alfa-7 na membrana foi significativamente maior em células N2a transfectadas alfa-7 do que em controles não transfectados. No pH 7,4, a fluorescência total de pHuji alfa-7 era visível na membrana plasmática.

em células N2a transfectadas. No pH 5,5, a fluorescência do pHuji alfa-7 foi reduzida, revelando localização interna dos receptores. A fluorescência externa do receptor alpha-7 pHuji explicou a maior parte da expressão dos receptores.

A quantificação mostrou que 82,6% dos receptores alpha-7 pHuji estavam localizados na membrana plasmática, enquanto 17,4% eram internos. A fluorescência foi restaurada ao retornar ao pH 7,4, confirmando a reversibilidade do sinal pHuji. No pH 7,4, células N2a que expressam alfa-4 SEP e beta-2 pHuji apresentaram robusta fluorescência de membrana para ambas as subuntas.

No pH 5,5, a fluorescência foi extinta, indicando localização interna de algumas subunidades alfa-4 SEP e beta-2 pHuji. A quantificação mostrou que 76,5% da SEP alfa-4 estava na membrana plasmática e 23,4% estava interna. Em células tripla transfectadas, a SEP alfa-4 apresentou 82,8% de localização de membrana e 17,2% de expressão interna.

Nas mesmas células, 63,4% das subunidades beta-2 pHuji estavam localizadas na membrana, enquanto 36,6% estavam localizadas intracelularmente. Usando o protocolo apresentado, caracterizamos novos efeitos de chaperona na expressão e tráfico de receptores nicotínicos, e avaliamos novas terapêuticas seletivas por alvos. Uma vantagem do nosso protocolo é a adaptabilidade para receptores nicotínicos homoméricos e heteroméricos, permitindo quantificar a localização celular relativa.

Nossa abordagem permite uma expressão rápida e robusta da membrana plasmática dos receptores nicotínicos, auxiliando na análise de tráfico mediado por chaperonas e nos esforços de descoberta de medicamentos.