Geração de um modelo baseado em organoides prostáticos de camundongos para estudar as interações hospedeiro-patógeno
27 de fevereiro de 2026
Este protocolo descreve a geração de um modelo murino baseado em organoide prostático cultivado em 2D. Inclui dissociação organoide, semeadura celular, diferenciação, avaliação da integridade epitelial e infecção in vitro com Escherichia coli uropatogênica. O modelo oferece acessibilidade apical e é adequado para estudar interações hospedeiro-patógeno, superando limitações dos sistemas organoides 3D tradicionais.
Esta pesquisa foca em entender como patógenos bacterianos infectam o epitélio da próstata e quais interações hospedeiro-patógeno determinam o desfecho da infecção. Modelos in vitro existentes capturaram mal a diversidade epitelial prostática. Esse modelo fornece um sistema fisiologicamente relevante que reflete os diferentes tipos celulares presentes no tecido.
Para começar, obtenha organoides prostáticos murinos tridimensionais cultivados em gotas de matriz extracelular em uma placa de 24 poços. Aspire o meio do número desejado de poços e adicione 500 microlitros de meio de cultivo fresco a cada poço. Usando uma pipeta P 1000, interrompa mecanicamente a queda da matriz extracelular em cada poço.
Colete essa suspensão em um tubo cônico de 15 mililitros, com no máximo dois poços coletados por tubo. Adicione um meio de cultivo fresco para aumentar o volume para 10 mililitros. Inverta suavemente o tubo três a quatro vezes para misturar e centrifuge a 450 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Aspire o sobrenadante. Resuspenda o pellet em dois mililitros de solução enzimática, pré-aqueça a 37 graus Celsius e incube a suspensão em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos. Usando uma pipeta P 1000, misture a suspensão celular a cada cinco minutos durante a incubação.
Após a incubação, adicione um substrato fresco para atingir um volume final de 10 mililitros. Inverta suavemente o tubo três a quatro vezes para misturar. Centrifuge a 450 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Aspire o sobrenadante sem mexer na bola. Re-suspenda o pellet em 300 microlitros de meio de cultura suplementado com 10 inibidores de rocha micromolar. Usando uma câmara de contagem de Neubauer, conte as células na suspensão.
Diluir a suspensão para uma concentração de 62.500 células por mililitro em meio de cultura suplementado com inibidor de rocha de 10 micromolares. Depois, seme 200 microlitros da suspensão por poço para uma placa de 48 poços e 300 microlitros por poço para microlâminas com câmara. Incube as placas em um incubador de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Após um dia, verifique se a maioria das células individuais está ligada à superfície bidimensional da cultura. Substitua o meio de cultura a cada dois a três dias e continue a cultivar até atingir a confluência em sete dias. Para induzir diferenciação para enriquecer células luminais, adicione 10 nanomolares de cinco alfa diidrotestosterona ou DHT à suspensão celular durante a semeadura.
Estire a cepa uropatogênica Escherichia coli, ou UPEC, em uma placa de ágar LB suplementada com 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube a placa a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas. Usando um laço estéril, inocule três mililitros de caldo LB suplementados com 100 microgramas por mililitro de ampicilina com uma única colônia bacteriana.
Incube a cultura estaticamente a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Faça vórtice na cultura bacteriana durante a noite. Meça a densidade óptica da cultura em 600 nanômetros.
Depois, calcule o volume de cultura necessário para alcançar uma densidade óptica inicial de 0,05 em três mililitros de caldo. Adicione o volume calculado de cultura bacteriana ao caldo fresco de LB suplementado com ampicilina. Incubar estaticamente a 37 graus Celsius por 24 horas.
Após a incubação, vórtice a cultura bacteriana. Meça a densidade óptica em 600 nanômetros. Calcule o volume de cultura necessário para alcançar uma densidade óptica de um.
Centrifugar o volume necessário a 12.000 G por dois minutos em temperatura ambiente. Aspire e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet bacteriano em um mililitro de primus e meio de cultivo organoide livre sem DHT.
Em seguida, dilua a suspensão com meio de cultura organoide prostática de camundongos para obter uma multiplicidade de infecção de 100. Aspire o meio de cultura a partir do modelo preparado baseado em organoides. Adicione 200 microlitros de meio de cultura contendo bactérias a cada poço de uma placa de 48 poços.
Incube por uma hora em incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Aspire as bactérias que contêm o meio dos poços e lave os poços três vezes com meio de cultivo fresco para remover bactérias extracelulares. Em seguida, adicione um meio de cultivo contendo 50 microgramas por mililitro de gentamicina e incube por 30 minutos.
Aspire o meio. Adicione um fresco de cultura, suplementado com 10 microgramas por mililitro de gentamicina durante o restante do tempo de infecção. Use um microscópio confocal para obter imagens das células infectadas após a coloração fluorescente e quantificar as células infectadas usando um citômetro de fluxo.
Na condição controle sem diidrotestosterona, a maioria das células apresentava citoqueratina: cinco células basais positivas, com apenas algumas apresentando baixa expressão luminal CD24 8. A suplementação com um nanomolar de DHT produziu populações basais luminais mistas, embora o CD 24A tenha permanecido baixo. Aumentar a DHT para 10 nanomolares promoveu a diferenciação em células luminais, mantendo algumas células basais após sete dias de cultivo.
Isso se correlacionou com estudos de quantificação que mostraram uma diminuição da citoqueratina em cinco células basais positivas e um aumento nas células luminais CD24A positivas com aumento da concentração de DHT ao longo do tempo. Em zero horas após a infecção, a UPEC aderia às células epiteliais em grande número. Após um tratamento com gentamicina por uma hora, o número de células positivas para UPEC caiu drasticamente.
Às 24 horas, o número de células infectadas era semelhante ao de uma hora. A imagem confocal em 24 horas mostrou que as bactérias intracelulares continuaram a se replicar, formando agrupamentos semelhantes a comunidades. Esse protocolo permite que pesquisadores estudem a dinâmica da infecção bacteriana e essas interações patogênicas em um modelo que preserva a diversidade celular epitelial.
Estudos futuros podem usar esse modelo para investigar diversas doenças da próstata, incluindo infecções, biologia do câncer e testar potenciais compostos terapêuticos.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo passo a passo para gerar um modelo de cultura bidimensional (2D) derivado de organoides prostáticos de camundongo. O modelo mantém características epiteliais fundamentais e permite acesso direto à superfície apical, possibilitando estudos detalhados das interações entre hospedeiro e patógeno, particularmente com Escherichia coli uropatogênica (UPEC). O protocolo inclui procedimentos de dissociação de organoides, semeadura celular, diferenciação e infecção, validados por imunofluorescência e ensaios funcionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia epitelial da próstata
- Interações entre hospedeiro e patógeno
- Modelos de cultivo celular e de organoides
Contexto
- Doenças prostáticas, como hiperplasia prostática benigna, prostatite e câncer de próstata, são prevalentes em homens idosos.
- Modelos de organoides replicam a estrutura e função epiteliais, mas limitam o acesso à superfície apical.
- Os modelos in vitro existentes não capturam completamente a diversidade das células epiteliais prostáticas.
- São necessários modelos aprimorados para estudar a dinâmica de infecção e os mecanismos das doenças.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um sistema de cultura 2D fisiologicamente relevante a partir de organoides de próstata de camundongo.
- Permitir o acesso experimental direto à superfície apical para estudos de infecção.
- Validar a diversidade epitelial do modelo e sua adequação para pesquisas sobre interações entre hospedeiro e patógeno.
Métodos Utilizados
- Dissociação de organoides prostáticos maduros de camundongo cultivados em matriz extracelular.
- Plaquiação de células dissociadas em superfícies de cultivo 2D com condições otimizadas para adesão e proliferação.
- Indução da diferenciação mediante suplementação com diidrotestosterona (DHT).
- Infecção do modelo 2D com ECPU e análise por microscopia de imunofluorescência, medidas de TER (resistência elétrica transepitelial) e citometria de fluxo.
Resultados Principais
- O modelo 2D manteve características epiteliais essenciais e diversidade celular.
- A suplementação com DHT modulou o equilíbrio entre populações de células basais e luminais.
- O UPEC aderiu a e invadiu células epiteliais, formando aglomerados intracelulares observados por microscopia confocal.
- O tratamento com gentamicina reduziu efetivamente as bactérias extracelulares, permitindo o estudo da dinâmica da infecção intracelular.
Conclusões
- O modelo derivado de organoides 2D fornece uma plataforma robusta para o estudo da biologia epitelial da próstata e das interações entre hospedeiro e patógeno.
- Permite a investigação detalhada da dinâmica de infecção e das respostas celulares.
- O modelo é adequado para estudos futuros sobre doenças da próstata e testes terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Modelos 2D derivados de organoides prostáticos preenchem uma lacuna crítica na pesquisa pré-clínica ao permitir a investigação direta das interações entre hospedeiro e patógeno na barreira epitelial. Este sistema preserva a diversidade celular e a função de barreira, oferecendo confiança preditiva na validação inicial de alvos e na redução de riscos mecanicistas em pesquisas sobre infecções e doenças da próstata. A relevância translacional da plataforma a posiciona como um recurso reutilizável para avaliação em toda a carteira de mecanismos de doenças e estratégias terapêuticas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação mecanicista das respostas epiteliais à infecção por Escherichia coli uropatogênica.
- Permite a validação funcional de alvos de interação hospedeiro-patógeno em um contexto fisiologicamente relevante.
- Facilita a desmistificação biológica por meio da modelagem de populações celulares basais e luminas.
- Melhora a confiança preditiva para estudos posteriores de biologia da infecção.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Oferece um sistema epitelial 2D padronizado e reproduzível para ensaios quantitativos de infecção.
- Permite acesso direto à superfície apical para aplicação de compostos ou patógenos.
- Suporta leituras baseadas em TER (resistência elétrica transepitelial) e imunofluorescência para avaliação da integridade da barreira e da diferenciação celular.
- Permite preparação escalonável para triagem de alto conteúdo de agentes moduladores de infecção.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se à biologia epitelial relevante para doenças, em modelos translacionais de infecção e doenças da próstata.
- Mantém a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica dos mecanismos hospedeiro-patógeno.
- Permite o avanço ajustado ao risco de hipóteses terapêuticas direcionadas a vias de infecção epitelial.
- Apoia a avaliação de intervenções candidatas em um sistema que reflete a diversidade celular in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo 2D baseado em organoides conecta a fase inicial de descoberta e a pesquisa pré-clínica de infecções, permitindo testes de hipóteses, validação de alvos e leituras quantitativas dentro de um fluxo de trabalho unificado.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação da hipótese nula de mecanismos de infecção e respostas epiteliais.
- Triagem: Fornece ensaios quantitativos e reprodutíveis de infecção e função de barreira para avaliação de compostos.
- Análises: Oferece saídas de imunofluorescência, TER (resistência elétrica transepitelial) e citometria de fluxo para comparação robusta de condições.
- Pesquisa Translacional: Mantém a organização celular relevante para a doença, garantindo continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para diversos estudos de doenças e infecções prostáticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na biologia da infecção.
- Valor Operacional: Padroniza ensaios de infecção epitelial com fluxos de trabalho escaláveis e reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/não prosseguir e triagem eficiente de portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas de infecção e doenças prostáticas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura de organoides, diferenciação epitelial e ensaios de infecção.
- Necessita de acesso à microscopia de imunofluorescência, equipamento para medida de resistência elétrica transepitelial (TEER) e citometria de fluxo.
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de semeadura celular, diferenciação e infecção.
- Adaptável a outros modelos epiteliais mediante otimização do protocolo para especificidade tecidual.
- A função de barreira e a diversidade celular devem ser validadas em cada lote experimental.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
3D Prostate Organoid Disruption into Single Cells
1:58
Plating Single-Cell Suspension onto a 2D Culture Surface
3:17
Preparation of Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) for Infecting the Organoids
5:12
Infecting the Prepared Prostate-Organoid Model with Uropathogenic Escherichia coli (UPEC)
6:16
Results
7:38
Conclusion
