Geração de um modelo baseado em organoides prostáticos de camundongos para estudar as interações hospedeiro-patógeno

Esta pesquisa foca em entender como patógenos bacterianos infectam o epitélio da próstata e quais interações hospedeiro-patógeno determinam o desfecho da infecção. Modelos in vitro existentes capturaram mal a diversidade epitelial prostática. Esse modelo fornece um sistema fisiologicamente relevante que reflete os diferentes tipos celulares presentes no tecido.

Para começar, obtenha organoides prostáticos murinos tridimensionais cultivados em gotas de matriz extracelular em uma placa de 24 poços. Aspire o meio do número desejado de poços e adicione 500 microlitros de meio de cultivo fresco a cada poço. Usando uma pipeta P 1000, interrompa mecanicamente a queda da matriz extracelular em cada poço.

Colete essa suspensão em um tubo cônico de 15 mililitros, com no máximo dois poços coletados por tubo. Adicione um meio de cultivo fresco para aumentar o volume para 10 mililitros. Inverta suavemente o tubo três a quatro vezes para misturar e centrifuge a 450 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Aspire o sobrenadante. Resuspenda o pellet em dois mililitros de solução enzimática, pré-aqueça a 37 graus Celsius e incube a suspensão em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos. Usando uma pipeta P 1000, misture a suspensão celular a cada cinco minutos durante a incubação.

Após a incubação, adicione um substrato fresco para atingir um volume final de 10 mililitros. Inverta suavemente o tubo três a quatro vezes para misturar. Centrifuge a 450 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Aspire o sobrenadante sem mexer na bola. Re-suspenda o pellet em 300 microlitros de meio de cultura suplementado com 10 inibidores de rocha micromolar. Usando uma câmara de contagem de Neubauer, conte as células na suspensão.

Diluir a suspensão para uma concentração de 62.500 células por mililitro em meio de cultura suplementado com inibidor de rocha de 10 micromolares. Depois, seme 200 microlitros da suspensão por poço para uma placa de 48 poços e 300 microlitros por poço para microlâminas com câmara. Incube as placas em um incubador de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após um dia, verifique se a maioria das células individuais está ligada à superfície bidimensional da cultura. Substitua o meio de cultura a cada dois a três dias e continue a cultivar até atingir a confluência em sete dias. Para induzir diferenciação para enriquecer células luminais, adicione 10 nanomolares de cinco alfa diidrotestosterona ou DHT à suspensão celular durante a semeadura.

Estire a cepa uropatogênica Escherichia coli, ou UPEC, em uma placa de ágar LB suplementada com 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube a placa a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas. Usando um laço estéril, inocule três mililitros de caldo LB suplementados com 100 microgramas por mililitro de ampicilina com uma única colônia bacteriana.

Incube a cultura estaticamente a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Faça vórtice na cultura bacteriana durante a noite. Meça a densidade óptica da cultura em 600 nanômetros.

Depois, calcule o volume de cultura necessário para alcançar uma densidade óptica inicial de 0,05 em três mililitros de caldo. Adicione o volume calculado de cultura bacteriana ao caldo fresco de LB suplementado com ampicilina. Incubar estaticamente a 37 graus Celsius por 24 horas.

Após a incubação, vórtice a cultura bacteriana. Meça a densidade óptica em 600 nanômetros. Calcule o volume de cultura necessário para alcançar uma densidade óptica de um.

Centrifugar o volume necessário a 12.000 G por dois minutos em temperatura ambiente. Aspire e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet bacteriano em um mililitro de primus e meio de cultivo organoide livre sem DHT.

Em seguida, dilua a suspensão com meio de cultura organoide prostática de camundongos para obter uma multiplicidade de infecção de 100. Aspire o meio de cultura a partir do modelo preparado baseado em organoides. Adicione 200 microlitros de meio de cultura contendo bactérias a cada poço de uma placa de 48 poços.

Incube por uma hora em incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Aspire as bactérias que contêm o meio dos poços e lave os poços três vezes com meio de cultivo fresco para remover bactérias extracelulares. Em seguida, adicione um meio de cultivo contendo 50 microgramas por mililitro de gentamicina e incube por 30 minutos.

Aspire o meio. Adicione um fresco de cultura, suplementado com 10 microgramas por mililitro de gentamicina durante o restante do tempo de infecção. Use um microscópio confocal para obter imagens das células infectadas após a coloração fluorescente e quantificar as células infectadas usando um citômetro de fluxo.

Na condição controle sem diidrotestosterona, a maioria das células apresentava citoqueratina: cinco células basais positivas, com apenas algumas apresentando baixa expressão luminal CD24 8. A suplementação com um nanomolar de DHT produziu populações basais luminais mistas, embora o CD 24A tenha permanecido baixo. Aumentar a DHT para 10 nanomolares promoveu a diferenciação em células luminais, mantendo algumas células basais após sete dias de cultivo.

Isso se correlacionou com estudos de quantificação que mostraram uma diminuição da citoqueratina em cinco células basais positivas e um aumento nas células luminais CD24A positivas com aumento da concentração de DHT ao longo do tempo. Em zero horas após a infecção, a UPEC aderia às células epiteliais em grande número. Após um tratamento com gentamicina por uma hora, o número de células positivas para UPEC caiu drasticamente.

Às 24 horas, o número de células infectadas era semelhante ao de uma hora. A imagem confocal em 24 horas mostrou que as bactérias intracelulares continuaram a se replicar, formando agrupamentos semelhantes a comunidades. Esse protocolo permite que pesquisadores estudem a dinâmica da infecção bacteriana e essas interações patogênicas em um modelo que preserva a diversidade celular epitelial.

Estudos futuros podem usar esse modelo para investigar diversas doenças da próstata, incluindo infecções, biologia do câncer e testar potenciais compostos terapêuticos.