Um pipeline computacional para quantificação de RNA intensificador intergênico/intragênico em células-tronco embrionárias de camundongo

Nosso grupo investiga epigenética e epitranscriptômica de aprimoradores, focando no desenvolvimento de métodos precisos para quantificar RNAs de potenciadores como indicadores de ativação de potenciadores. Como os realçadores intragênicos estavam com os transcritos do hospedeiro, distinguir sinais de DER do aprimorador e quantificá-los com precisão é desafiador. Para começar, abra o terminal e digite o comando para preparar os arquivos e referências necessários para identificação do aprimorador.

Digite o comando no terminal para entrar no diretório de trabalho. Depois, execute o comando que copia os scripts de identificação do aprimorador para o diretório atual. Depois, execute o comando correspondente para gerar arquivos BED para regiões promotoras, corpos gênicos e genes codificadores de proteínas usando anotação de código gen.

Preparar os arquivos ATAC-seq e histona ChIP-seq para identificação de aprimoradores. Insira o comando de pré-processamento apropriado no terminal. Em seguida, execute o comando para definir e classificar os aprimoradores usando dados de pico de cromatina.

Digite o comando para atribuir informações temporárias da cadeia ao arquivo BED do aprimorador intergênico. Em seguida, insira o comando para determinar a direção correta da fita para potenciadores intergênicos que se sobrepõem aos genes localizados em ambas as fitas. Depois, calcule RPKM específico da cadeia para genes que sobrepõem potenciadores na mesma cadeia.

Depois, entre no comando para finalizar a atribuição das cadeias para potenciadores intergênicos. Atribua a informação final da cadeia a todos os potenciadores intergênicos e suas regiões de cume correspondentes. Digite o comando no terminal para mover para o diretório raiz do pipeline.

Em seguida, use o comando apropriado para copiar o script de preparação da análise a jusante Usando o comando apropriado, prepare todos os arquivos necessários para agregação de aprimoradores, processamento de sinais GRO-seq e quantificação de RNA de aprimoradores. Em seguida, digite o script para entrar no diretório de trabalho e copie os scripts necessários para análise posterior. Criar gráficos de agregação, mostrando padrões de sinais de cromatina ao redor de cada tipo de cume de potenciador.

Digite o comando correspondente no terminal. Assim que o prompt retorna, insira o comando para quantificar os níveis de expressão de RNA do aprimorador do GRO-seq usando contagens de características. Por fim, execute o script para visualizar e comparar os níveis de expressão de RNA do aprimorador entre grupos de aprimoradores usando R.In o conjunto de dados GRO-seq.

Caudas de polinucleotídeos estavam presentes antes do corte e removidas com sucesso após aplicar os conjuntos de dados ATAC-seq da extremidade prejudicada dos parâmetros de corte. As sequências do adaptador NextEra foram detectadas em ambos os pares vermelhos antes do corte e removidas após o pré-processamento dos conjuntos de dados ChIP-seq para acetilação H3K27 mostrarem contaminação mínima por adaptadores, exigindo apenas o corte padrão. A filtragem dos dados do ATAC-seq resultou em 71.165 regiões de cromatina aberta não motoras, incluindo 47.317 regiões de realçadores, das quais 23.147 foram classificadas como ativas e 24.170 como não ativas com base na sobreposição com marcas de histonas; entre todas as regiões de realçador, 45,2% eram intergênicas e 54,8% eram intragênicas. Essa distribuição foi semelhante entre categorias de potenciadores não ativos e ativos.

Um aprimorador intergênico a montante do gene NENO mostrou forte enriquecimento para sinais de ATAC-seq, monometilação H3K4, acetilação H3K27 e sinais GRO-seq. Um aprimorador intragênico próximo ao gene CHD2 apresentou características de cromatina e transcrição semelhantes ao realçador NENOG, com sinais claros em todos os quatro conjuntos de dados. Gráficos de agregação mostraram que os realçadores ativos apresentaram enriquecimento coordenado dos sinais de ATAC-seq, monometil H3K4 e acetilação H3K27.

Enquanto os realçadores não ativos não apresentavam enriquecimento de acetilação H3K27, mas mantinham fortes sinais de ATAC-seq e H3K4 monometil. Os realçadores ativos apresentaram transcrição significativamente maior derivada do GRO-seq do que os não ativos tanto em regiões intergênicas quanto intragênicas. Montamos esses pipelines de computação de eRNA conscientes de tendências, validados por transcrição dependente da atividade em contextos intergênicos ou intragênicos.

Abordamos a DER de uma quantificação padronizada e acessível de eRNA, especialmente para potenciadores intragênicos confundidos pelo genoma do hospedeiro. Revisaremos a identificação autoguiada, separaremos transcritos operacionais tanto das tendências quanto do pipeline de análise de benchmark em montagens genômicas, protocolos experimentais e tipos celulares.