Investigação de um dispositivo LED de luz azul para suprimir patógenos de feridas usando um modelo de pele sintética à base de colágeno

Nossa pesquisa investiga como uma luz azul de 405 nanômetros pode suprimir patógenos de feridas com segurança, utilizando um modelo de pele sintética à base de colágeno. A maioria dos estudos utiliza culturas de caldo, placas de ágar ou modelos animais. Introduzimos uma plataforma realista e reprodutível de imitação da pele para testes de fototerapia.

Para começar, obtenha as cepas bacterianas e fúngicas desejadas. Escolha uma colônia isolada e inocule-a assépticamente em cinco mililitros de caldo de soja trippto. Uma vez que todas as cepas estejam inoculadas, incube as culturas.

Após o tempo desejado de incubação, ajuste a turbidez usando PBS estéril para o padrão de McFarland de 0,5 para ensaios antimicrobianos. Em seguida, pegue seções sintéticas hidratadas à base de colágeno previamente preparadas e inocule cada seção com 100 microlitros de suspensão microbiana. Usando um espalhador estéril, distribua a suspensão uniformemente pela superfície.

Depois, secar ao ar as amostras inoculadas em uma câmara estéril sob condições ambientes. Alocar as amostras a três grupos de tratamento para diferentes exposições à luz. Para irradiação, monte o dispositivo LED de luz azul em um dissipador de calor de alumínio.

Use um medidor de potência óptica calibrado para medir a irradiância no plano exato de tratamento. Ajuste a altura da sonda para considerar a espessura do sensor. Agora ajuste a distância de alcance do LED para padronizar a irradiância de trabalho para 30 miliwatts por centímetro quadrado.

Coloque as amostras de pele inoculadas do grupo B assépticamente em placas de Petri estéreis sem tampa. Posicione as antenas diretamente sob o LED da luz azul e irradie por 15 minutos para alcançar uma fluência alvo de 27 joules por centímetro quadrado. De forma semelhante, irradie o grupo C sob luz UVC por dois minutos para alcançar uma fluência alvo de 3,6 joules por centímetro quadrado.

Após a irradiação, transfira a amostra sintética tratada para um tubo estéril de 15 mililitros contendo nove mililitros de PBS no pH 7,4 e faça um vórtice suave para desalojar microrganismos aderentes à superfície. Agora prepare diluições seriadas dez vezes maiores da suspensão. Coloque 100 microlitros das diluições selecionadas nas placas de ágar e incube as placas.

Ao final do período de incubação, conte o número de colônias e registre o número de unidades formadoras de colônias. Calcule a redução microbiana usando as equações apresentadas. Para simular a exposição nosocomial pelo ar, utilize uma câmara de aerossol acrílico personalizada sob condições ambientais controladas.

Coloque placas de ágar estéreis dentro da câmara para monitorar a atividade da queda microbiana. Depois, posicione as amostras de pele estéreis dentro da câmara. Usando um nebulizador, aerossolize dois mililitros de suspensão microbiana na câmara e exponha as amostras a luz azul contínua a 10 microwatts por centímetro quadrado a partir de uma distância de 20 centímetros por 30 minutos.

Para o controle, repita condições idênticas da câmara com o dispositivo de luz azul desligado. Quantifique as contagens viáveis a partir das amostras por meio da análise padrão de contagem de placas. Para análise FTIR, obtenha amostras sintéticas de pele e hidrate-as conforme as instruções do fabricante.

Divida as amostras hidratadas em quatro conjuntos sobre uma superfície estéril. Expõe dois conjuntos de amostras a luz azul de 405 nanômetros com intensidade de 30 miliwatts por centímetro quadrado. Exponha um conjunto por 15 minutos e o outro por 60 minutos.

Da mesma forma, exponha dois conjuntos de amostras a luz UVC de 265 nanômetros com intensidade de três miliwatts por centímetro quadrado, com um conjunto exposto por 15 minutos e o outro por 60 minutos. Após a irradiação, limpe suavemente as amostras para remover a umidade da superfície. Analise as amostras usando espectroscopia FTIR para avaliar mudanças químicas e estruturais.

Configure o instrumento FTIR em modo ATR e prepare a superfície do cristal para a colocação da amostra. Coloque a amostra sobre o cristal ATR para aquisição espectral. Realize comparações espectrais diretas entre amostras controle não tratadas e amostras irradiadas.

Em seguida, use a amostra controle não tratada como referência de fundo e escaneie as amostras irradiadas para obter espectros subtraídos de base. O dispositivo de LED de luz azul demonstrou eficácia antimicrobiana significativa contra todos os patógenos de feridas testados em modelos de pele sintética. Reduções médias de logarígrafos revelam diferenças dependentes da espécie na suscetibilidade, com Klebsiella pneumoniae demonstrando a maior sensibilidade à luz azul e Staphylococcus aureus apresentando redução comparativamente menor, embora ainda significativa.

A irradiação UVC alcançou maiores reduções microbianas em todas as espécies testadas. A luz azul e a irradiação UVC demonstraram atividade antimicrobiana de amplo espectro contra patógenos bacterianos clinicamente relevantes, incluindo Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans. A exposição à luz azul causou uma redução dependente do tempo nos três patógenos da ferida, com Escherichia coli e Candida albicans sendo inativados rapidamente, e Staphylococcus aureus apresentando um declínio progressivo mais lento.

A eficácia da luz azul foi avaliada ainda sob condições simuladas de contaminação aérea. A exposição contínua diminuiu significativamente a deposição microbiana nas superfícies sintéticas da pele em relação aos controles não tratados para cada espécie avaliada. Espectros ATR-FTIR corrigidos pela linha de base indicaram que o tratamento com UVC reduziu a intensidade dos picos de amida e aumentou as vibrações de estiramento carbono-oxigênio, refletindo a degradação do colágeno.

Em contraste, a exposição à luz azul não induziu mudanças espectrais ou químicas significativas. Esse método avalia fontes de luz fototerápicas testando a eficácia antimicrobiana, preservando a integridade e a segurança do colágeno em superfícies semelhantes à pele. O principal desafio desse protocolo é manter uma irradiância uniforme e um controle preciso da fluência das fontes de luz para garantir resultados antimicrobianos reprodutíveis.

Esse protocolo pode ser estendido para testes de biofilme, análise de estresse oxidativo, otimização de dispositivos de luz de próxima geração e triagem de intervenções terapêuticas semelhantes e inovadoras.