Uma Técnica Simples de Microaspiração para Isolar Células Somáticas de Sêmen Equino Criopreservado como Doadores Nucleares para Clonagem

Nosso objetivo é mostrar que células somáticas do sêmen criopreservado de cavalos podem ser úteis para recuperar indivíduos de alto valor genético. Nosso desafio atual é conseguir selecionar células somáticas com DNA diploide intacto para serem usadas como doadoras nucleares. Para começar, remova os canudos de sêmen equino do tanque de nitrogênio líquido.

Exponha-os ao ar por 10 segundos e descongele-os em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 segundos. Pegue uma amostra de 250 microlitros do sêmen descongelado. Dilua com um mililitro de meio DMEM-F12 suplementado.

Incube a mistura de sêmen a 37 graus Celsius por 30 minutos. Pipete 25 microlitros da diluição incubada para um tubo e dilua em 975 microlitros de DPBS suplementados com 0,1 miligrama por mililitro de álcool polivinílico ou polivinil pirrolida. Misture suavemente a suspensão.

Mantenha a mistura de sêmen diluído a 37 graus Celsius durante todo o processo de coleta celular. Coloque uma tampa de placa de Petri contendo sêmen equino diluído no palco do microscópio para preparar a coleta de células somáticas. Selecione uma micropipeta de diâmetro adequado para coleta de células somáticas e conecte-a ao sistema mecânico de aspiração.

Insira cuidadosamente a micropipeta no micro drop e alinhe-a com a base da tampa do prato. Uma vez que a pipeta aspira o meio de cultivo, inicie a captura individual das células somáticas. Foque na parte inferior da microqueda, onde várias morfologias celulares são visíveis.

Posicione a ponta da micropipeta ao lado de cada célula somática e aspire sob pressão negativa. Colete células todas as redondas e alongadas, independentemente do tamanho. Após coletar 10 células, deposite-as em uma microgota de 10 microlitros localizada na superfície superior da tampa da panela.

Retenha todas as células somáticas coletadas dentro desse micro drop durante todo o processo de coleta. Uma vez coletado o número desejado de células somáticas, realize um procedimento simples de lavagem usando microgotas para remover espermatozoides, detritos e contaminantes microbianos. Usando uma segunda tampa de prato, realize uma lavagem sequencial de três etapas das células somáticas.

Use uma micropipeta para transferir as células somáticas para a primeira gota e deixe-as se acalmar por três a cinco minutos. Transfira as células da primeira gota para a segunda gota usando o mesmo procedimento. Repita a transferência mais uma vez e coloque as células somáticas na terceira gota.

Por fim, deposite as células somáticas isoladas em uma micro gota preparada designada para transferência nuclear de células somáticas. A técnica de microaspiração recuperou com sucesso células somáticas de sêmen equino criopreservado, com taxas de captura variando de 317,7 a 424,7 células por hora em três garanhões. Garanhão número 3 mostrando o maior rendimento.

Cinco tipos distintos de células somáticas foram identificados com base no tamanho e na morfologia. Identificamos uma população de células somáticas que difere em morfologia e viabilidade no sêmen equino criopreservado, que pode ser útil como doador nuclear. As células podem ser selecionadas com base em sua morfologia, e o procedimento não requer o estabelecimento de cultura primária.

Vamos focar em melhorar a viabilidade dessas células após o aumento do volume do sêmen equino.