Coloração com peroxissomos em células de mamíferos usando sondas específicas de peroxissomos

Nossa pesquisa foca em entender os peroxsomos, que são organelas essenciais para o metabolismo lipídico e o equilíbrio oxidativo celular. Nosso objetivo é descobrir como sua estrutura e função são reguladas e como esses processos mudam na doença. Para alcançar isso, desenvolvemos sondas fluorescentes que permitem a nós e à comunidade científica em geral visualizar peroxissomos em uma variedade de células animais.

Aqui, desenvolvemos protocolos de coloração que atuam tanto em células vivas quanto fixas, fornecendo ferramentas poderosas para estudar a biologia da paroxetina em saúde e patologia. Um dos principais desafios experimentais é alcançar a marcação não invasiva dos peroxissomos em células animais. Embora a coloração por anticorpos ajude a superar isso, há uma falta de anticorpos comercialmente disponíveis para proteínas paroxísticas.

Outro desafio é visualizar peroxossomos de forma não invasiva em tempo real, o que requer protocolos adaptáveis. E, por fim, a coloração convencional não fornece uma leitura funcional. Enquanto a coloração baseada em peroxidase pode variar dependendo da função paroxística, o que é tanto um desafio quanto uma oportunidade, pois nos permite distinguir estados funcionais paroxísticos dentro da célula.

Comece com células de mamíferos semeadas no dia anterior em um prato com coberturas, que agora estão em uma confluência de 30 a 70%. Dilua a sonda peroxissoma com um meio fresco em um tubo microcentrífugo sensível à luz para alcançar uma concentração final de quatro micromolares. Selecione o poço desejado para tingir e rotule o lado de fora usando uma caneta de caneta.

Aspire 0,5 mililitros de meio do poço selecionado e substitua pelo meio de sondagem preparado gota a gota ao longo da parede do poço. Após a dispensação, incube as células a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. A partir desse ponto, proteja as células da luz usando papel alumínio.

Após a incubação, remova cuidadosamente o meio manchado e lave as células duas vezes com PBS. Depois, coloque a placa sob um capuz químico, adicione 4% de paraformaldeído em PBS às células e incube em temperatura ambiente por 20 minutos. Após a fixação, retire o paraformaldeído em um recipiente de resíduos designado e lave as células uma vez com PBS.

Em seguida, adicione 0,5% de Triton X em PBS para permeabilizar as células e incubar por 2,5 minutos. Após a incubação, retire o Triton X e lave as células duas vezes com PBS por 10 minutos cada. Para bloquear as células, incube-as com albumina sérica bovina 5% em PBS durante a noite a quatro graus Celsius.

Realize o procedimento de coloração imunofluorescente seguindo o protocolo padrão. Por fim, realize microscopia para adquirir imagens tanto de células fixas quanto vivas. A coloração de células vivas com sondas Peroxi_SPY resultou na importação dependente da subfamília D de cassetes que se ligam ao ATP em peroxissomos, produzindo uma alta relação de fluorescência peroxissoma para citoplasma em células metabólicamente ativas.

Em células selvagens HEK-293T que expressam GFP-SKL, a coloração Peroxi_SPY555 mostrou colocalização distinta com peroxissomos, enquanto nas células knockout PEX19 que não possuem peroxissomos, a coloração não existiu. Em fibroblastos humanos, Peroxi_SPY coloração colocalizada com o marcador paroxístico GFP-SKL, confirmando o direcionamento peroxissoma. A quantificação da densidade dos peroxissomos revelou variação significativa entre diferentes tipos celulares.

Condições otimizadas de coloração em células COS-7 usando 250 nanomolares Peroxi_SPY por 20 minutos aumentaram significativamente a razão de fluorescência peroxissoma para citoplasma em comparação com o protocolo original de um micromolar por 10 minutos. A incubação prolongada de células HEK-293T com Peroxi_SPY por 24 horas levou a uma relação de intensidade de fluorescência peroxissoma para citoplasma melhorada em comparação com 15 minutos, apesar da redução da coloração por peroxissomo. Um protocolo de fixação permitiu o atenuamento eficaz de anticorpos, demonstrado por marcagem Peroxi_SPY preservada e imunocoloração com Anti-PEX14 em células HuH-7 e HEK-293T.

A quantificação mostrou que os procedimentos de fixação e permeabilização afetavam a intensidade da fluorescência de peroxissomos em comparação com a coloração de células vivas. Desenvolvemos o corante Peroxi_SPY que pode ser usado para visualizar peroxissomos tanto em células vivas quanto fixas de animais. Nossa sonda fluorescente pode oferecer um método simples e rápido para estudar dinâmica dos peroxissomos, heterogeneidade e disfunção de maneiras que antes eram limitadas.

Esse protocolo permitirá pesquisas com peroxossomos baseadas em imagem em diversos tipos celulares, incluindo células derivadas de pacientes com distúrbios paroxísticos.