Modelagem da Metástase Cerebral: Análise Padronizada da Colonização Metastática e Padrões de Crescimento Histológico por Injeção Intracortical Estereotáxica

Nosso grupo investiga como as células tumorais colonizam o cérebro e como os padrões de crescimento metastático influenciam os resultados clínicos e as respostas ao tratamento. Para começar, pese cada camundongo usando uma balança de precisão para calcular o volume necessário de anestésico com base no peso corporal. Após administrar o anestésico, coloque o rato em uma almofada térmica pré-quente, mantida entre 37 e 38 graus Celsius para apoiar a termorregulação, depois aplique pomada para proteger a córnea do ressecamento.

Prepare o rato usando uma técnica asséptica aprovada pelo comitê local de ética animal. Desinfete cuidadosamente o couro cabeludo usando uma solução à base de iodo. Confirme a profundidade da anestesia com um beliscão no dedo do pé, depois estique a pele até ficar esticada e faça uma incisão na linha média de aproximadamente três a quatro milímetros ao longo do crânio usando um bisturi estéril.

Usando o mesmo bisturi, raspe suavemente o periósteo para expor a superfície do crânio. Prenda a cabeça do mouse em um frame estereotáxico usando barras auriculares. Usando o braço estereotáxico, localize o bregma, depois mova o braço dois milímetros para frente e um milímetro para a direita, e marque o local alvo no córtex frontal com um marcador cirúrgico.

Perfure cuidadosamente o crânio no local marcado usando uma furadeira dentária de precisão, garantindo que a dura-máter não seja penetrada. Confirme a abertura sondando suavemente o local com uma pinça estéril. Em seguida, ressuspenda a suspensão das células tumorais pipetando para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme.

Coloque três microlitros da suspensão em uma seringa Hamilton de 10 microlitros e coloque-a no quadro estereotáxico usando o suporte apropriado. Posicione cuidadosamente a agulha da seringa sobre o buraco, garantindo que o bisel fique voltado para a esquerda para garantir a consistência da injeção. Insira a agulha verticalmente no tecido cerebral até uma profundidade de 3,5 milímetros.

Uma vez atingida a profundidade necessária, retire lentamente a agulha em 0,5 milímetros para ajudar a prevenir o refluxo da suspensão celular e injete lentamente três microlitros da suspensão celular tumoral ao longo de um minuto. Após a injeção, mantenha a agulha no lugar por mais dois minutos para permitir que as células e a matriz extracelular se estabilizem e minimizem o refluxo. Depois, retire cuidadosamente a seringa e retire o mouse da estrutura estereotáxica.

Enxague suavemente o crânio com uma solução estéril de cloreto de sódio 0,9% e fele o buraco da refura usando cera óssea. Feche a incisão no couro cabeludo usando três a quatro pontos que amarram cada ponto com três nós apertados próximos às bordas da ferida para uma cicatrização ideal. Marque as orelhas do rato usando um padrão de perfuração auricular apropriado correspondente ao número de identificação designado.

Depois, reaplique pomada ocular se necessário para evitar o ressecamento da córnea durante a recuperação e retorne o camundongo a uma almofada térmica pré-quente mantida entre 37 e 38 graus Celsius para auxiliar na recuperação da anestesia. Limpe e desinfete cuidadosamente a seringa Hamilton enxaguando a agulha e o barril três vezes sequencialmente, primeiro com água destilada, depois com etanol 70% e, finalmente, com solução estéril de cloreto de sódio 0,9%. Após enxaguar, armazene a seringa Hamilton no gelo até o próximo uso.

Por fim, administre analgésicos por via subcutânea enquanto o camundongo ainda está sob anestesia para garantir alívio imediato da dor pós-operatória. Camundongos domésticos individualmente durante a recuperação por um breve período, não excedendo uma hora, para evitar ferimentos causados por interações entre animais acordados e em recuperação. Se sinais de sofrimento ou comportamento anormal forem observados durante o período de monitoramento, avalie a função neurológica usando o teste do fio suspenso para avaliar a força de pega e a coordenação.

Suspenda um mouse em um fio horizontal e registre se ele alcança uma plataforma de fuga em até 60 segundos. Um rato não saudável não alcança a plataforma e cai do fio. Após a eutanasia e coleta dos tecidos animais, avalie o padrão histológico de crescimento da metástase e as características associadas nas lâminas digitais de tecido.

Imagens macroscópicas confirmaram a ausência de crescimento tumoral em camundongos da válvula de controle C injetados por ECM, enquanto lesões metastáticas visíveis estavam presentes em camundongos injetados com suspensões de ECM de células tumorais. Ratos injetados com células de câncer de mama 4T1 ou 410,4 apresentaram uma carga metastática significativamente maior em comparação com controles injetados por ECM, sem diferença significativa entre as duas linhas celulares tumorais. A análise de sobrevivência de Kaplan Meyer demonstrou que camundongos injetados com 410,4 células tumorais tiveram uma sobrevivência geral significativamente maior em comparação com aqueles injetados com células 4T1.

A análise histológica mostrou que as metástases cerebrais 4T1 e 410,4 apresentaram padrões de crescimento distintos, com 4T1 apresentando crescimento epitelial infiltrativo em forma de fio e 410,4 mostrando crescimento epitelial infiltrativo em forma de fio. A injeção estereotáxica inadequada levou ao crescimento tumoral no crânio e meninges devido ao vazamento de suspensão celular, enquanto a injeção intracortical adequada resultou em metástase parênquima com disseminação meníngea subsequente. Demonstramos que os padrões de crescimento das metástases cerebrais influenciam o prognóstico e a morte neurológica, apoiando a relevância para orientar a tomada de decisão clínica.

Esse protocolo é particularmente útil para estudar a colonização metastática em estado tardio, abordando aspectos clinicamente relevantes, como dinâmica de crescimento e disseminação secundária. Diferentemente de outros métodos, o modelo estereotáxico assegura a colonização específica do cérebro e preserva a complexidade total do sistema, permitindo estudos de longo prazo sobre progressão tumoral e resposta terapêutica. Ao fornecer uma plataforma clinicamente reprodutível e relevante, nosso modelo contribui para entender os mecanismos da colonização cerebral e explorar novas estratégias terapêuticas.