Imagem de cálcio baseada em fluorescência em culturas epiteliais primárias das vias aéreas humanas usando segmentação celular automatizada

Transcriptômicas unicelulares revelam heterogeneidade no epitélio das vias aéreas com fibrose cística. Pretendemos entender como as funções e mudanças específicas de tipo celular afetam a patogênese da doença. O desafio atual é medir com precisão a proteômica e as funções de células únicas.

Isso ainda exige desenvolvimento técnico. Para começar, mantenha as células de Calu-3 em frascos T-25 contendo o Meio Mínimo Essencial de Cultura de Eagle suplementado com 20% de FBS e 1% de penicilina estreptomicina. Quando as células atingirem aproximadamente 70% de confluência, lave as células com cinco mililitros de PBS.

Após lavar, adicione um mililitro de Triple diretamente sobre as células e coloque o frasco em uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 10 a 15 minutos. Depois, neutralize o TrypLE adicionando quatro mililitros de meio de cultivo completo e fresco e misture bem a suspensão celular. Placar as células em uma placa de 96 poços com aproximadamente 90% a 100% de confluência, correspondendo a cerca de 40.000 células por poço.

Deixe as células aderirem à placa de 96 poços durante a noite. Mude o meio todos os dias e continue cultivando as células por dois a cinco dias após a confluência para permitir a diferenciação. No dia do experimento, lave as células de Calu-3 e incube-as com corantes apropriados.

Em seguida, adicione 100 microlitros por poço de probenecídeo 2,5 milimolares diluído em tampão de cálcio para manter o corante dentro do espaço citoplasmático e envolva a placa em papel alumínio para protegê-la da luz até a imagem. Para células primárias das vias aéreas. Remova o meio basolateral do poço de transpoço e lave o lado apical adicionando 300 microlitros de tampão de cálcio.

Depois, lave o lado basolateral adicionando 750 microlitros de tampão de cálcio. Remova o buffer pipetando e repita a lavagem mais uma vez dos dois lados. Em seguida, incube as células com 200 microlitros de solução de corante no lado apical e 600 microlitros no lado basolateral por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Durante a incubação, prepare thapsigargin diluído em tampão de cálcio como um estoque intermediário três vezes. Ajuste a concentração para seis micromolares para alcançar uma concentração final de dois micromolares no poço. Após a incubação, remova a solução de corante tanto dos compartimentos apical quanto basolateral por pipeteamento.

Lave as células duas vezes com 300 microlitros de tampão de cálcio para o lado apical e 750 microlitros de tampão de cálcio para o lado basolateral. Depois, remova o buffer pipetando. Em seguida, adicione 100 microlitros de probenecídeo 2,5 milimolar em tampão de cálcio ao compartimento apical e adicione 500 microlitros da mesma solução ao compartimento basolateral.

Mantendo o insert transwell dentro da placa, envolva toda a placa em papel alumínio para protegê-la da luz e deixe a placa enrolada de lado para a imagem. Abra o formulário de Fiji. Selecione Arquivo e escolha Abrir para enviar o arquivo de vídeo.

Na janela de pop-up resultante, mantenha todas as configurações padrão e confirme a seleção. Se desejar, ajuste a exibição da imagem selecionando Imagem, escolhendo Ajustar e clicando em Contraste de Brilho. Modificar o brilho e o contraste dos canais de fluorescência individuais para alcançar uma visão ótima das células.

Para facilitar o rastreamento de células, mesture canais selecionando Imagem, escolhendo Cor e clicando em Molhar Canais. Na janela pop-up, atribua os arquivos apropriados a cada canal individual e confirme a seleção. Para rastreamento, selecione Analisar, Escolher Ferramentas e abra o ROI Manager.

Na janela pop-up resultante, ative as opções Mostrar Tudo e Etiquetas. Usando a ferramenta de seleção à mão livre, traçe cuidadosamente as células individuais com base nos limites celulares e na coloração nuclear. Depois, pressione a tecla T para adicionar cada célula traçada à lista de retorno do investimento.

Certifique-se de que as células sejam traçadas em todos os quatro cantos do campo de visão e no centro do vídeo. Depois que todas as células tenham sido rastreadas corretamente, dentro da janela do Gerenciador de ROI, clique em Mais e selecione Multi Measure. Na janela pop-up resultante, pressione OK para iniciar a medição.

Abra o arquivo de vídeo em Fiji. Otimize os canais de fluorescência nuclear e verde para visualização usando as ferramentas de ajuste de imagem. Depois que os canais estiverem otimizados, duplique um único quadro selecionando Imagem e escolhendo Duplicar.

Na janela pop-up resultante, desmarque Pilha Duplicada e salve a imagem duplicada como um arquivo de imagem PNG. Repita a duplicação de quadros para o outro canal selecionando Imagem e escolhendo Duplicar. Na janela pop-up, pressione OK e salve a imagem como um arquivo PNG.

Misture as duas imagens salvas selecionando Imagem, escolhendo Cor e clicando em Molhar Canais. Depois, atribua cada arquivo PNG ao canal apropriado e confirme a fusão. Faça upload da imagem mesclada na célula após a interface gráfica para gerar uma máscara de célula.

Segmente a imagem usando a coloração nuclear como canal um e a coloração citoplasmática é o canal dois, selecionando o modelo cyto3. Agora, salve a imagem da máscara gerada como um arquivo PNG. Abra em Fiji e converta para um arquivo TIFF.

Por fim, abra tanto o arquivo de máscara quanto o arquivo de vídeo original na suíte de cálcio arrastando e soltando na interface do software. Clique em Analisar Dados para gerar um gráfico para download e um arquivo CSV para download contendo valores de intensidade normalizados e brutos para todas as células analisadas. A intensidade de fluorescência normalizada para o nível de base aumentou ao longo do tempo em células individuais de Calu-3 após estimulação com thapsigargin quando medida com Fluo-4 AM e Cal-520 AM, a ativação máxima da fluorescência dependente de cálcio após a thapsigargin foi significativamente maior nas células Calu-3 medidas com Cal-520 AM em comparação com Fluo-4 AM. De forma semelhante, as vias aéreas primárias individuais e as células brônquicas apresentaram aumento da fluorescência normalizada ao longo do tempo após a estimulação com thapsigargin usando qualquer um dos corantes.

Além disso, a ativação máxima da fluorescência dependente de cálcio foi significativamente maior em células carregadas com Cal-520 AM. A análise baseada em aprendizado de máquina identificou e quantificou mudanças de fluorescência dependentes do cálcio em 1.441 células individuais, a partir de um único campo de visão. Traços de fluorescência normalizados gerados pelo software mostraram respostas de cálcio para todas as 1.441 células identificadas após estimulação com thapsigargina. Nossos estudos ajudarão a entender as respostas de diferentes tipos celulares ao ambiente, o que auxiliará no desenvolvimento de terapias direcionadas.

Nossas descobertas têm o potencial de focar em tipos celulares distintos, atribuindo certas respostas de células vivas a estímulos ambientais. No futuro, pretendemos explorar como a sinalização específica de tipo celular em doenças e células saudáveis é alterada para determinar os tipos responsáveis.