Configuração Reprodutível para Imagem de Dois Fótons In Vivo da Contratilidade dos Vasos Linfáticos Cervicais e do Fluxo Linfático em Camundongos

Apresentamos a necessidade de uma nova imagem da contratilidade dos vasos linfáticos cervicais e da remoção linfática de glóbulos vermelhos em camundongos. Estudar as funções dos vasos linfáticos cervicais é desafiador, especialmente quando é necessária observação a longo prazo da contratilidade do fluxo linfático e das circulações traçadoras. Para começar, coloque um trilho óptico de aço medindo 270 milímetros de comprimento e 43 milímetros de largura como base do dispositivo.

Instale dois suportes de postes sobre o trilho óptico de aço, garantindo uma distância de 175 milímetros entre eles. Insira dois postes de montagem com diâmetro de 12 milímetros nos suportes de postes e fixe cada um usando um parafuso M6. Depois, prenda uma coleira de poste em cada um dos dois postes de fixação.

Fixe uma gramposa fixa em ângulo reto em um dos postes de fixação e prenda-a firmemente usando um parafuso M6. Insira um poste de montagem de 12 milímetros no furo lateral do grampo de poste em ângulo reto. Prenda um suporte impresso em 3D ao suporte lateral inserido e prenda-o firmemente usando dois pares de parafusos M3.

Usando cola curável por UV, fixe um vidro de cobertura de 12 milímetros de diâmetro na parte inferior de uma carcaça protetora impressa em 3D. Depois, fixe a carcaça protetora ao suporte impresso em 3D usando um par de parafuso/porca M4. Instale uma mesa pantógrafa de precisão para movimento vertical na base do trilho óptico de aço usando dois clipes de mesa e conjuntos de parafusos, porcas e arruelas M6.

Depois, coloque uma caixa impressa em 3D medindo 155 milímetros de comprimento e 110 milímetros de largura sobre a mesa. Essa caixa serve como reservatório para a acumulação de solução salina. Cubra o ponto de conexão dos fios ao elemento de aquecimento um com uma fina camada de silicone.

Fixe o sensor de temperatura um no tapete e o sele com silicone. Solde os fios do elemento de aquecimento e dos sensores de temperatura a um cabo multifio. Preencha o ponto de conexão com silicone e feche usando filme plástico.

Coloque o elemento de aquecimento dois e o sensor de temperatura dois no rolo de espuma. Fixe os conectores do cabo de energia e do botão de energia nas paredes do gabinete da unidade de controle. Instale uma fonte de alimentação de corrente contínua de 24 volts, um conversor de corrente contínua com redução gradual e dois módulos MOSFET dentro do gabinete.

Depois de montar o circuito e soldar os componentes necessários, fixe o Arduino Uno e a tela do teclado na carcaça da tampa. Localize o campo de seleção de temperatura. Ajuste a temperatura e pressione o run.

Após anestesiar o rato, aplique pomada ocular em ambas as pálpebras para evitar o ressecamento dos globos oculares durante a cirurgia. Quando o reflexo de retirada da pata traseira e o reflexo de recolher a cola da cauda cessarem, coloque o rato de costas sobre o elemento de aquecimento para dar acesso à região abdominal. Conecte a unidade de controle em uma tomada elétrica com tensão de entrada de 175 a 240 volts de corrente alternada.

Usando fita médica, fixe o corpo do animal em uma posição paralela à superfície da mesa e coloque a cabeça em ângulo em relação ao eixo sagital, de modo que um lado do pescoço repouse sobre o rolo. Enrole uma ligadura ao redor dos incisivos superiores e prenda-a na parte de trás do dispositivo, usando fita médica para ajudar a manter a temperatura corporal do animal. Em seguida, raspe o pelo da região do pescoço.

Depois, remova quaisquer pelos soltos restantes e cubra o animal para preservar o campo estéril. Para a desinfecção primária, desinfete a pele do pescoço usando um swab de álcool. Depois, aplique uma solução de clorexidina 0,5% ou uma solução de iodo 2% para tratamento antisséptico e repita o processo de desinfecção mais duas vezes.

Após confirmar a profundidade anestésica pelo reflexo de beliscão do dedo do pé, realize uma dermatotomia fazendo uma incisão longitudinal ao longo da pele do pescoço, desde a mandíbula inferior até a clavícula, com aproximadamente dois centímetros de comprimento. Depois, realize uma fasciotomia usando tesoura curva microcirúrgica. Usando pinças curvas, afaste suavemente as glândulas salivares e os músculos superficiais do pescoço para expor o músculo esternocleidomastoide.

Certifique-se de que os vasos sanguíneos visíveis não sejam danificados e umedeça continuamente o campo cirúrgico com soro fisiológico para evitar danos nos tecidos. Use tesouras microcirúrgicas para realizar uma miotomia do músculo esternocleidomastoide, proporcionando acesso à região entre a traqueia e a artéria carótida. Continue espalhando músculos e fáscia, realizando tanto miotomia quanto fasciotomia.

Em seguida, localize o linfonodo cervical profundo junto com os vasos linfáticos aferentes e eferentes a uma profundidade de cinco a sete milímetros. Coloque o dispositivo que segura o animal fixo sobre a mesa móvel do microscópio. E fixe o dispositivo firmemente com um parafuso M6 para garantir estabilidade durante a imagem.

Prenda o cateter, pré-preenchido com solução salina, ao poste de montagem usando fita médica. Coloque um rolo com diâmetro de um centímetro sob o elemento de aquecimento na lateral da cabeça do animal para manter uma inclinação de 45 graus em relação à mesa do microscópio. Em seguida, posicione o cateter fixo na área do pescoço aberta cirurgicamente para que fique próximo à região da clavícula do animal e ligue o suprimento de soro para preencher a cavidade aberta do pescoço com solução salina.

Abaixe a carcaça protetora sobre a área do pescoço, preenchida com soro fisiológico, de modo que o vaso linfático fique no centro do campo de observação. Depois, coloque a carcaça protetora na traqueia sem exercer pressão. Por fim, abaixe a lente de dois fótons sem imersão em água na carcaça protetora até a profundidade correta baseada na distância de trabalho da lente e realize a visualização de dois fótons do vaso linfático cervical.

Após o procedimento, a identificação bem-sucedida dos linfonodos cervicais profundos foi confirmada pelo acúmulo de Evans Blue no tecido. O monitoramento com dois fótons da contratilidade do vaso linfático cervical foi realizado antes e depois da fotobiomodulação. A fotobiomodulação aumentou significativamente a contratilidade do vaso linfático cervical em camundongos de 2 e 18 meses com intensidade semelhante.

A análise quantitativa mostrou que a contratilidade dos vasos linfáticos cervicais foi significativamente menor em camundongos de 24 meses em comparação com camundongos de 2 e 18 meses. No entanto, os valores não foram significativamente diferentes entre camundongos de 2 e 18 meses. A fotobiomodulação aumentou significativamente a contratilidade dos vasos linfáticos cervicais em camundongos de 2 e 18 meses, mas não teve efeito em camundongos de 24 meses.

Glóbulos vermelhos injetados no ventrículo lateral direito foram observados nos vasos linfáticos cervicais quatro horas após a injeção e continuaram a circular pelo lúmen às cinco horas, confirmando o fluxo direcional do cérebro para a periferia. Nosso protocolo facilita o monitoramento in vivo da função dos vasos linfáticos cervicales, mantendo a contratilidade por até cinco horas de observação. Nosso método oferece boa reprodutibilidade e é compatível com vários microscópios de dois fótons e lentes objetivas, mantendo imagens de alta qualidade com profundidades de até 500 micrômetros.

Essa técnica pode potencialmente se tornar uma ferramenta universal para estudar a fisiologia do sistema de drenagem cerebral e as funções dos vasos linfáticos cervicais.