Abordagem Multimodal para Avaliar a Regeneração Óssea e o Desempenho em Andaimes

Nossa pesquisa avalia como diferentes biomateriais influenciam-cee-atacan na arquitetura óssea durante o processo de regeneração. A regeneração óssea requer uma avaliação multiescala, pois é um tecido organizado hierarquicamente. Esse protocolo permite a análise da amostra em diferentes escalas.

Para começar, fixe a tíbia embutida em resina contendo o biomaterial implantado no suporte da amostra e prenda-a ao braço do instrumento. Oriente a amostra de acordo com a direção de seção desejada. Adquira um disco de serra de diamante de baixa velocidade para seccionar o osso em fatias de aproximadamente 0,7 milímetro.

Encha o reservatório de líquido até que o nível do fluido cubra completamente a borda inferior da pá. Certifique-se de que a amostra esteja estável e alinhada horizontalmente com a superfície do disco. Ajuste a posição da amostra usando os botões de posicionamento até que a região de corte do alvo esteja alinhada com a lâmina.

Comece a cortar a amostra usando uma velocidade mais alta e aplique baixa pressão até que uma marca se forme. Depois, reduza a velocidade para completar a separação suavemente e minimizar a vibração. Pare a serra imediatamente após o corte terminar.

Depois, examina a amostra cortada usando um microscópio estereoscópico para montagem. Para montagem, utilize um conjunto caseiro composto por um cilindro interno sólido de aço inoxidável e um cilindro oco externo que fornece suporte mecânico durante o polimento. Em seguida, coloque o cilindro interno sobre uma placa quente e aqueça-o a aproximadamente 120 a 140 graus Celsius.

Escolha uma cera adequada e aplique uma pequena quantidade de cera na superfície do cilindro aquecido, deixando-a derreter completamente. Depois, coloque a amostra com a superfície de interesse voltada para baixo sobre a área revestida com cera e pressione suavemente a amostra para garantir o contato total com a cera derretida. Depois, retire o cilindro de alumínio da placa elétrica e deixe a cera solidificar em temperatura ambiente.

Para polimento grosseiro e intermediário, selecione lixa com granulação de 1, 200, 2, 500 e 4, 100 para reduzir a espessura da amostra para aproximadamente 0,15 milímetros. Comece com lixa de 1 de 200 de grão, seguida de 2 de 500 de grão, aplicando uma leve pressão. Periodicamente, monitore a espessura da amostra durante o polimento usando microscopia de reflexão.

Quando a espessura alvo for atingida, polia ambos os lados da amostra usando lixa de grão 4 de 100. Limpe continuamente a amostra com água destilada em cada etapa de polimento. Para o polimento final, escolha uma pasta de diamante com tamanho de partículas de seis ou três micrômetros, com base na rugosidade da superfície da amostra.

Aplique uma pequena quantidade de pasta de diamante em um pano de polimento de feltro, montado em um disco de polimento, e polia a amostra. Para separar a amostra do cilindro, aqueça a cera em uma placa quente. Após remover a unidade da placa elétrica, retire a amostra do cilindro.

Depois, polia suavemente ambos os lados da amostra usando pressão mínima e seque a superfície polida com papel de filtro. Antes da análise por microscopia, monte a amostra entre uma lâmina de vidro e o revestimento usando óleo de imersão como meio de montagem. Examine a orientação das fibras de colágeno usando microscopia de luz polarizada, começando com baixa ampliação entre 5x e 10x.

Por fim, prepare a amostra para microscopia eletrônica de varredura para analisar melhor a interface osso-biomaterial. Após o polimento e o exame inicial por microscopia óptica, as características intrínsecas da amostra permitiram que a região identificada sob microscopia óptica fosse correspondida à localização correspondente no conjunto de dados de tomografia microcomputizada. A microscopia de luz polarizada diferenciou ossos pré-existentes, mostrados em azul, do osso recém-formado durante a cicatrização e retratado em laranja.

Microscopia de luz polarizada com maior ampliação revelou uma interface onde o osso crescia em oposição próxima ao osso cortical pré-existente, com fibras de colágeno Tipo I orientadas perpendicularmente em uma região fina. A microscopia eletrônica de varredura permitiu a localização precisa de áreas de interesse. Um volume da região selecionada foi examinado adicionalmente usando tomografia de corte e visualização.

A face da trincheira apresentava morfologia óssea em uma trabecula em crescimento. A microscopia eletrônica de transmissão permite o exame em escala nanométrica da interface osso-biomaterial, que pode ser combinada com difração de elétrons em áreas selecionadas. Padrões de difração de elétrons de área selecionada indicaram que tanto a região do biomaterial quanto a região óssea eram compostas por cristais de hidroxiapatita.

O mapeamento espectroscópico de raios X dispersivo de energia da região de interface visualizada mostrou fósforo e cálcio. Esse fluxo de trabalho multimodal fornece insights complementares que não podem ser alcançados por uma única técnica de imagem. Esse fluxo de trabalho exige tempo significativo, expertise técnica e acesso a instrumentação especializada.

Ele pode investigar correlações funcionais, remodelação óssea de longo prazo e design de biomateriais.