Name: Imagem de Superresolução de Célula Inteira via DNA-PAINT em um disco confocal giratório com reatribuição óptica de fótons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprenda a realizar microscopia de localização de moléculas individuais em células inteiras usando DNA-PAINT com microscópio confocal de disco giratório e reatribuição óptica de fótons. Este protocolo simplificado elimina a necessidade de óptica personalizada.

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<ol><li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+light+sheet+allows+volumetric+super-resolution+imaging+of+efflux+pumps+distribution+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms.</a> Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Ghosh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+interplay+of+CD20+and+therapeutic+antibodies+with+fast+volumetric+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy.</a> Science. 387 (6730), eadq4510(2025).</li>
<li>Wäldchen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Cell+imaging+of+plasma+membrane+receptors+by+3D+lattice+light-sheet+d+STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM.</a> Nat Commun. 11 (1), 887(2020).</li>
<li>Zagato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+devices+for+single+objective+single+plane+illumination+microscopy+%28SoSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+express%22%5BJournal%5D)">Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM).</a> Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
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<li>Schueder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+super-resolution+imaging+of+whole+cells+using+spinning+disk+confocal+microscopy+and+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT.</a> Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).</li>
<li>Azuma, T., Kei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+spinning-disk+confocal+microscopy+using+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment.</a> Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instant+super-resolution+imaging+in+live+cells+and+embryos+via+analog+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing.</a> Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).</li>
<li>Zaza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+in+whole+cells+and+tissues+via+DNA-PAINT+on+a+spinning+disk+confocal+with+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment.</a> Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+and+super-resolution+microscopy+by+fluorescence+imaging+of+transient+binding+on+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami.</a> Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+accuracy+in+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Localization accuracy in single-molecule microscopy.</a> Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).</li>
<li>Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTetley%2C+R+%22NIS-Elements+JOB+for+DNA-Paint+Acquisition+at+Serial+Z-Planes%22">NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes</a>. , (2025).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).</li>
<li>Schlichthaerle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+single+nuclear+pore+complex+proteins+using+genetically-encoded+probes+for+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT.</a> Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).</li>
<li>Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat-top+TIRF+illumination+boosts+DNA-PAINT+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification.</a> Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).</li>
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<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+microtubule+ultrastructure+based+on+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy.</a> Cytoskeleton. , (2025).</li>
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<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore+dimers+for+DNA-PAINT+and+STED+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy.</a> Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).</li>
<li>Chung, K. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNA-PAINT+for+faster%2C+low-background+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico</td><td>Merck&nbsp;</td><td>238813-5G</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>3,4-ácido di-hidroxibenzóico &nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>37580-25G-F</td><td>PCA</td></tr><tr><td>60 e vezes; Lente objetiva Apo NA 1.49</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.0 KDA coluna de dessalinização de spin contendo resina de exclusão de tamanho &nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>89882</td><td>Colunas de Dessalinização Zeba Spin para o passo 2.4</td></tr><tr><td>Accutase - Meio de Descolamento de Células Enzimáticas</td><td>Célula Promocional</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP acoplado a DNA personalizado (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')</td><td>Fotônica Massiva</td><td>Produto personalizado</td><td>Nanocorpo anti-GFP para Drosophila</td></tr><tr><td>Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP acoplado a DNA</td><td>Fotônica Massiva</td><td>MASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3</td><td>Nanocorpo anti-GFP para NUP</td></tr><tr><td>Anti-alfa tubulina (YL1/2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-80017</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coelho IgG</td><td>Fotônica Massiva</td><td>Massive-sdAB-FAST 2-Plex, Secundário sdAB F2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR&zeta; (6B10.2)</td><td>BioLegend</td><td>644102</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sérica bovina</td><td>Merck&nbsp;</td><td>A4503-10G</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Tubo centrífugo cônico 15 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>17705004</td><td></td></tr><tr><td>Tubo centrífugo cônico 50 mL</td><td>VWR International</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 SoRa</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscópio SDC-OPR</td></tr><tr><td>Dessalinização de colunas de spin com Sephadex G-25 (resina de exclusão de tamanho para purificação de DNA) e nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11743309</td><td>Marca: Cytiva. Colunas G-25 para o passo 2.5</td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Mídia DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Anidro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp; (Dithiothreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15976082</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Marck</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Serva</td><td>2311402</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5516-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>MP Biomédicos</td><td>219482580</td><td></td></tr><tr><td>Maleimida-PEG2-succinimidil&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>746223-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Mídia 5A da McCoy</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MES (ácido 2-(N-morfolino)etanolsulfônico)</td><td>Merck</td><td>M3671-50G</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>32213-25L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10418464</td><td></td></tr><tr><td>Tubos microcentrífugas 0,5 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11508232</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>10509691&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-Vis de Microvolume</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-UM-W</td><td>Nanodrop</td></tr><tr><td>NaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6546-1L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas 90 nm - Ouro</td><td>Citodiagnóstico</td><td>G-90-100</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CMOS Orca Fusion-BT</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>P/S</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (solução 1x)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11530546</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pierce 16% formaldeído (w/v), livre de metanol</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11586711</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>&nbsp; P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Protocatechuto 3,4-Dioxigenase &nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P8279-25UN&nbsp;</td><td>PCD</td></tr><tr><td>Sódio&nbsp; Hidróxido</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12963614</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo TOM20</td><td>Abcam</td><td>Ab186735</td><td></td></tr><tr><td>Tampão Tris</td><td>VWR International</td><td>A4577.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tritão&nbsp; X-100&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR International</td><td>1086031000</td><td></td></tr><tr><td>Pré-adolescente-20</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de filtro centrífugo de ultrafiltração, MWCO de 100 kDa</td><td>Merck&nbsp;</td><td>UFC510024</td><td>Fabricante: Amicon Ultra</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 Poços Fundo de Vidro Alto</td><td>Ibidi</td><td>IB-80807</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-Slide VI 0.5 Vidro Inferior</td><td>Ibidi</td><td>IB-80607</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de superresolução de célula inteira via dna-paint em um disco confocal giratório com reatribuição óptica de fótons

Whole-cell Super-Resolution Imaging via DNA-PAINT on a Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment

Para demonstrar as capacidades de imagem de super-resolução do sistema SDC-OPR (Figura 1A), sua resolução no plano foi avaliada por meio da realização de experimentos de imagem DNA-PAINT (Figura 1B) em complexos de poros nucleares (NPCs), que são uma estrutura de referênciabiológica 17. A Figura 1C mostra uma imagem representativa DNA-PAINT SDC-OPR da nucleoporina 96 (Nup96), marcada com proteína fluorescente verde aprimorada por monomérica (mEGFPs) e marcada com nanocorpos anti-GFP conjugados com DNA, em células U2OS. Os painéis ampliados revelam a subestrutura NUP, e a Figura 1D mostra proteínas Nup96 pareadas (indicadas por setas) consistentes com a simetria esperada de 8 vezes dos poros nucleares. Na Figura 1E, a distância euclidiana entre pares Nup96 foi medida alinhando-os e plotando o histograma da seção transversal da imagem somada (n = 16 pares). A análise revelou uma separação pico a pico de (13 ± 2) nm (Figura 1E), em concordância com os resultados dos modelos EM, bem como das imagens HILO eTIR 23. Cada ajuste de pico apresentou um desvio padrão de 4 nm, confirmando a alta precisão de localização (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) alcançada usando DNA-PAINT no SDC-OPR. Notavelmente, essa precisão foi mantida em todo o campo de visão de 53 × 53 μm², o que é excepcional para sistemas baseados em confocais.
Para demonstrar a capacidade de imagem multicolorida, o Nup96, as mitocôndrias e os microtúbulos em células U2OS foram marcados com DNA para aquisição usandoExchange-PAINT 18. Essa técnica utiliza fitas ortogonais de imager de DNA conjugadas a um único fluoróforo, permitindo que todos os alvos sejam excitados com a mesma fonte de laser (Figura 2A). Em vez de adquirir sinais simultaneamente, ele os separa em rodadas sequenciais de imagem, facilitando a integração direta em qualquer sistema comercial SDC-OPR. A Figura 2B mostra Nup96 em azul marcado com um nanocorpo anti-GFP, mitocôndrias em vermelho com um anticorpo anti-TOM20 secundário, e microtúbulos em verde com um anticorpo primário anti-α-tubulina. Notavelmente, a excepcional precisão de localização de molécula única obtida para a imagem Nup96 de cor única foi preservada em todos os alvos do experimento multi-alvo, resultando em valores de precisão de localização de 3,9 nm para o NPC, 4,0 nm para α-tubulina e 3,3 nm para mitocôndrias (Figuras 2B painéis 1, 2 e 3).
Para imagens de grande campo de visão, microtúbulos em células HeLa foram fotografados usando várias ampliações disponíveis no sistema SDC-OPR, combinadas com diferentes configurações de binning da câmera para manter tamanhos de pixels entre 78 nm e 108 nm (Figura 3). A Figura 3A mostra o citoesqueleto microtubular de 10 células HeLa, com cores representando precisão de localização. Com 1× de ampliação, a precisão média de localização é visivelmente pior em comparação com ampliações maiores (Figura 3B-D), com maior variabilidade observada. Isso se deve à redução da densidade de potência do laser em relação ao campo de visão maior, onde o perfil de iluminação gaussiano se torna aparente, levando a uma precisão menor em direção às bordas do campo de visão. No entanto, alcançar uma precisão média de localização de 9,5 nm no amplo campo de visão de 211 × 211 μm² é impressionante para sistemas baseados em confocais e permite uma investigação de alta resolução da heterogeneidade biológica.
Por fim, a possibilidade de imagens de células inteiras é demonstrada pela obtenção de imagens DNA-PAINT da rede de microtúbulos em células fixas HeLa com volume confocal de ~500 nm de espessura e 1 μm de passo z, usando a maior ampliação do sistema (4×, 53 × 53 μm² FOV). A Figura 4A apresenta as imagens de reconstrução de molécula única para cada plano z, juntamente com a precisão de localização correspondente e os valores de NeNA. Além disso, uma visualização 3D renderizada em cor da rede de microtúbulos na célula HeLa é fornecida na Figura 4C. À medida que a profundidade aumenta, o número de fótons detectados diminui devido ao espalhamento e às aberrações ópticas, resultando em redução da precisão de localização tanto para as precisões de localização derivadas do Cramér-Rao Lower Bound (CRLB) (Figura 4A, à direita) quanto para aquelas calculadas usando a métrica NeNA. Ainda assim, o alto nível de coleta de fótons possível pelo sistema SDC-OPR permite σSMLM ≤ 10 nm para até 9 μm de profundidade de imagem com distribuições estreitas. De fato, estruturas de microtúbulos filamentosos de dupla parede foram claramente resolvidas em várias profundidades: próximo à interface coverslip-célula, em posições axiais intermediárias e no topo da célula, com distância pico a pico entre 30 nm e 40 nm (Figura 4C), consistente com os valoresrelatados 24. Esses resultados destacam a capacidade do SDC-OPR de fornecer imagens de alta resolução em grandes FOVs e em toda a altura das células.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Microscopia de localização de molécula única no plano de diferentes amostras celulares e imagem multicolorida em super-resolução. (A) Esquema do sistema Confocal de Disco Giratório com Reatribuição de Fótons Ópticos (SDC-OPR), apresentando um arranjo de microlentes projetado para maximizar a coleta de fótons. (B) Esquema do DNA-PAINT: Fitas de DNA marcadas fluorescentemente, conhecidas como fitas de imager, hibridizam transitoriamente com sequências complementares de DNA (fitas de acoplamento) que são ancoradas ao anticorpo/nanocorpo que tem como alvo da proteína de interesse. Esses eventos de ligação de curta duração geram sinais de fluorescência que aparecem como piscar estocástico. (C) Imagem representativa DNA-PAINT no sistema SDC-OPR usando ampliação de 4× do NPC das células U2OS. A capacidade de alta resolução é demonstrada no inset, onde NPCs individuais são claramente resolvidos. (D) DNA-PAINT aprimorado com SDC-OPR permite a visualização de NPCs individuais, onde setas brancas destacam pares característicos de proteínas Nup96 dentro da arquitetura do poro. (E) Distribuição das medições de distância entre dímeros Nup96 (n=16 pares) dentro de unidades de simetria NPC simples. Esse valor foi modificado a partir de Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a> 
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Exchange-PAINT para imagem multicolorida usando um microscópio SDC-OPR. (A) Esquema do Exchange-PAINT de três alvos capturados sequencialmente. Três alvos proteicos foram marcados com anticorpos funcionalizados pelo DNA, fragmentos de Fab ou nanocorpos. As fitas do imager Cy3B foram imagens sequencialmente por tipo de fio, com etapas de lavagem entre as rodadas de imagem. (B) Imagem Exchange-PAINT em três cores de células U2OS usando microscopia SDC-OPR usando ampliação 4×, mostrando microtúbulos (vermelho; rotulados com anti-α-tubulina conjugada com DNA), mitocôndrias (verde; DNA-nanocorpos com alvo TOM20), e NPC (azul; Nup96 marcado com mEGFP e nanocorpos de DNA anti-GFP). Barra de escala: 5 μm. A região ampliada enfatiza a resolução aprimorada obtida no sistema SDC-OPR, focando em (1) mitocôndrias, (2) microtúbulos e (3) NUP. Barras de escala = 1 μm. Esse valor foi modificado a partir de Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Imagem DNA-PAINT dentro de grandes FOVs em um microscópio SDC-OPR. Imagens de DNA-PAINT de microtúbulos (marcação anti-α-tubulina) adquiridas em múltiplas ampliações: (A) ampliação de 1× e 1 binning (FOV de 211 × 211 μm²), (B) binning de 2,8× e 2 (FOV de 76 × 76 μm²), (C) ampliação de 4× e 4 binning (FOV de 53 × 53 μm²). A cor representa a precisão de localização de 0 a 16 nm no caso de ampliação de 1x e de 0 a 4 nm nas demais. (D) Precisão de localização medida a diferentes distâncias (em μm) do centro do campo de visão para ampliações de 1× (vermelho), 2,8× (amarelo) e 4× (verde). Esse valor foi modificado a partir de Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Imagem de DNA de célula inteira - PAINT. (A) Esquerda. Imagem volumétrica de microtúbulos em células HeLa via DNA-PAINT adquirida usando SDC-OPR a 4× de ampliação, mostrando seções axiais de z = 0 a 9 μm (passos de 1 μm). Cada plano exibe posição z , precisão de localização e métrica NeNA. Barras de escala: 5 μm (xy). Certo. Precisão de localização versus profundidade de penetração para todos os aviões. (B) Renderização 3D da rede de microtúbulos na mesma célula HeLa que em (A). A cor representa profundidade de penetração de 0 a 9 μm. (C) Imagens ampliadas de pequenas regiões destacadas de cada profundidade de penetração indicadas em (A). Esse valor foi modificado a partir de Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>

Imagem de Superresolução de Célula Inteira via DNA-PAINT em um disco confocal giratório com reatribuição óptica de fótons

Single-molecule localization microscopy (SMLM) enables nanoscale imaging of cellular structures but is typically restricted to imaging near the coverslip ...

Nosso protocolo utiliza DNA-PAINT em um microscópio confocal de disco giratório com reatribuição óptica de fótons para superar limitações de profundidade. O DNA-PAINT agora alcança um nível extremamente alto de resolução com multiplexes e capacidades quantitativas, superando outras técnicas SMLM como PALM e STORM. Para começar, use um sistema confocal de disco giratório equipado com uma unidade óptica de reatribuição de fótons e uma câmera sCMOS.Ligue o sistema 30 minutos antes da imagem, ligando o microscópio, a câmera e os lasers. Depois ligue o computador. Espere o software NIS-Elements carregar completamente.Agora, selecione o modo de imagem apropriado em NIS-Elements escolhendo SoRa Spinning Disk antes de definir parâmetros de aquisição. Escolha o objetivo de imersão em óleo com abertura numérica Apo 60x 1,49 para maximizar a detecção de eventos de molécula única. Depois, selecione a ampliação apropriada com base no objetivo, configurações da câmera e amostra.Ajuste a curvatura da câmera de acordo com a ampliação selecionada. Defina o tempo de exposição para aquisição do DNA-PAINT. Agora, configure o comprimento de onda do laser, a potência do laser e a roda do filtro de acordo com o espectro de corantes do imager.Para registrar a potência do laser após o objetivo, coloque um sensor calibrado de medidor de potência a laser no palco do microscópio próximo ao plano da amostra e registre a potência medida. Em seguida, aplique uma gota de óleo de imersão no óleo limpo de abertura numérica Apo 60x 1,49. Fixe a amostra de célula imunocolorida preparada no palco do microscópio usando um adaptador de palco para minimizar a deriva.Mude para o modo campo claro e foque no plano de vidro usando nanopartículas como referência. Depois, ative o Sistema de Foco Perfeito para manter o foco durante a aquisição. Com o Sistema Perfect Focus ativo, altere temporariamente a excitação para o canal fluorescente verde da proteína para identificar o plano focal ideal.Use baixa potência do laser nessa etapa. Defina o nome do experimento e o caminho de salvamento. Marque a caixa de tempo para definir o intervalo, duração e número de loops.Defina o intervalo para Sem Atraso e insira o número de loops correspondente ao número total de quadros. Certifique-se de que a caixa PFS na parte inferior esteja selecionada. Volte para as configurações de excitação SoRa previamente definidas e pressione Executar Agora.Adquira de 15.000 a 20.000 quadros para a primeira proteína, usando um tempo de integração de 300 milissegundos. Para análise de imagens, carregue a pilha de imagens desconvolutas no módulo localizado de Picasso. Selecione Analisar e depois Parâmetros na barra de menu e insira os parâmetros específicos da câmera de acordo com as especificações do fabricante.Em seguida, ajuste o comprimento do lado da caixa para sete para otimizar a precisão da localização de molécula única. Escolha um valor mínimo adequado de gradiente líquido e permita a visualização para visualizar localizações detectadas. Ajuste o limiar de gradiente para minimizar detecções de fundo.Agora, selecione Analisar e depois Localizar para iniciar a identificação e ajuste de pontos em todos os quadros. Carregue o hdf5 resultante no módulo Picasso Render para visualizar o mapa de localização reconstruído. Escolha Pós-processamento e depois Desderiva pelo RCC.Insira um valor inicial de segmentação começando em 1.000 para obter um gráfico de deriva xy. Repita com valores de segmentação mais baixos para melhorar a correção de deriva. Clique em Arquivo e Salvar Localização para salvar o arquivo de localização corrigido por deriva antes de fechar o módulo de renderização.Agora, carregue o arquivo corrigido por deriva no módulo Picasso Filter e aplique limiares baseados na precisão de localização, larguras da função de espalhamento pontual, contagem de fótons e outras métricas de qualidade. Clique em Arquivo e Salvar Localização para salvar o arquivo de localização filtrado antes de fechar o módulo de filtro. A imagem DNA-PAINT de nucleoporina 96 marcada com proteína fluorescente verde aprimorada por monomérica em células U2OS produziu um padrão claro e super-resolvido de complexo de poros nucleares em todo o campo de visão.Vistas ampliadas revelaram subunidades pareadas de nucleoporina 96 dispostas com a simetria esperada de oito vezes dos poros nucleares. A medição da distância euclidiana entre pares alinhados de nucleoporina 96 mostrou uma separação pico a pico de 13 mais ou menos 2 nanômetros. Nucleoporina 96, mitocôndrias e microtúbulos foram visualizados simultaneamente em células U2OS com precisão preservada de localização de molécula única em todos os alvos.Grande campo de visão A imagem de microtúbulos em células HeLa demonstrou que a precisão de localização variava com a ampliação e o tamanho do campo, sendo observada redução de precisão em ampliações menores. Ampliações maiores produziam uma precisão de localização melhor e mais uniforme em comparação com a ampliação 1x. A imagem de célula inteira foi demonstrada pela aquisição por DNA-PAINT da rede de microtúbulos através de múltiplos planos axiais que abrangem toda a profundidade celular.A precisão de localização diminuiu gradualmente com o aumento da profundidade de imagem. Estruturas de microtúbulos de parede dupla foram resolvidas em múltiplas posições axiais com distâncias de pico a pico entre 30 e 40 nanômetros. Nosso protocolo alcança imagens profundas de DNA-PAINT em células e tecidos sem sacrificar a resolução, utilizando óptica simples e comercialmente disponível.DNA-PAINT de alta resolução funciona principalmente sob TIRF ou alta iluminação, restringindo a profundidade de imagem a apenas alguns micrômetros. Nossas descobertas tornam o DNA-PAINT acessível a muitos laboratórios, possibilitando imagens em nanoescala em células e tecidos em profundidade.

whole-cell-super-resolution-imaging-via-dna-paint-on-spinning-disk

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descreve-se um método de resolução super-imaging para sondar a organização estrutural da bacteriano FtsZ-ring, um aparelho essencial para a divisão celular. Este método baseia-se em análises quantitativas de microscopia fotoativados localização (PALM) imagens e pode ser aplicado a outras proteínas do citoesqueleto bacterianas.

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Nós descrevemos como implementar microscopia localização fotoativados (PALM) baseada em estudos de vesículas em fixos, neurônios cultivados. Os principais componentes do nosso protocolo incluem rotulagem vesículas com quimeras photoconvertible, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia de super-resolução e processamento das imagens em bruto para produzir uma imagem de super-resolução.

Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core

Informações espaço-temporais sobre proteínas dinâmicas dentro de células vivas são cruciais para a compreensão da biologia. Um tipo de microscopia de super-resolução chamada microscopia de iluminação rápida estruturada em 3D (f3D-SIM) revela informações únicas sobre o anel Z citocinético em bactérias: tanto sua aparência semelhante a um grânulo quanto a dinâmica rápida do FtsZ dentro do anel.

Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

Este protocolo descreve as etapas necessárias para obter resultados de localização Subcellular da proteína na retina de zebrafish, correlacionando a microscopia de luz super resolução e imagens de microscopia eletrônica de varredura.

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Este artigo descreve um protocolo para a detecção de um ou mais plasma e/ou proteínas de membrana intracelular usando microscopia de super-resolução depleção do estado fundamental (GSD) em células de mamíferos. Aqui, vamos discutir os benefícios e as considerações do uso de tais abordagens para a visualização e a quantificação de proteínas celulares.

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

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Imagem tridimensional de células bacterianas para representações celulares precisas e localização precisa de proteínas

Apresentado aqui é um protocolo para imagens de células vivas de super-resolução em tecido intacto. Nós padronizamos as condições para a imagem de uma população de células-tronco adultas altamente sensíveis em seu ambiente de tecido nativo. Esta técnica envolve o equilíbrio da resolução temporal e espacial para permitir a observação direta de fenômenos biológicos no tecido vivo.

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Imagem de Superresolução de Célula Inteira via DNA-PAINT em um disco confocal giratório com reatribuição óptica de fótons

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