Name: Desenvolvimento e Padronização de um Micrométodo Ex Vivo para Quantificação Intracelular da Vincristina em Células Primárias de ALL por LC-MS/MS (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a desenvolver um método LC-MS/MS para quantificar a acumulação intracelular de vincristina em células primárias de leucemia linfoblástica aguda pediátrica. Esta abordagem validada melhora o monitoramento terapêutico clínico.

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<ol><li>Inaba, H., Pui, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).</li>
<li>Pui, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+progress+through+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2938-2948 (2015).</li>
<li>Gaudichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+extramedullary+relapse+in+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+reconciling+biological+concepts+and+clinical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues.</a> Blood Rev. 36, 40-56 (2019).</li>
<li>Dhyani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+potential+of+alkaloids%3A+a+key+emphasis+on+colchicine%2C+vinblastine%2C+vincristine%2C+vindesine%2C+vinorelbine+and+vincamine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine.</a> Cancer Cell Int. 22, 206(2022).</li>
<li>Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+intracellular+unbound+drug+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations.</a> Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).</li>
<li>Chien, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+to+determine+intracellular+drug+concentrations+in+cellular+uptake+assays%3A+application+to+metformin+in+organic+cation+transporter+1-transfected+human+embryonic+kidney+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells.</a> Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).</li>
<li>Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+drug+resistance-linked+ABC+transporters+in+cancer+cells+by+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).</li>
<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+a+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).</li>
<li>Borgmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+ALL+blasts+retain+phenotypic+and+genotypic+characteristics+upon+long-term+serial+passage+in+NOD%2FSCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice.</a> Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).</li>
<li>Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+leukemia+relapse+to+induction+chemotherapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> J Vis Exp. (224), e68797(2025).</li>
<li>Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+effect+in+bioanalysis+of+illicit+drugs+with+LC-MS%2FMS%3A+influence+of+ionization+type%2C+sample+preparation%2C+and+biofluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).</li>
<li>Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+sample+preparation+approach+for+mass+spectrometry-based+profiling+of+plasma+results+in+improved+coverage+of+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome.</a> J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+standard+variability%3A+root+cause+investigation%2C+parallelism+for+evaluating+trackability+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations.</a> Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Frasco de tampa roscada de 2,0 mL</td><td>Fornecimento de fluxo</td><td>8-2400</td><td>Usado com inserções de vidro com mola (5 x 29 mm) da mesma empresa (Cat. 5-29015)</td></tr><tr><td>Frasco de tampa roscada de 2,0 mL</td><td>Fornecimento de fluxo</td><td>8-2400</td><td>Usado com inserções de vidro com mola (5 x 29 mm) da mesma empresa (Cat. 5-29015)</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>100030</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>24010152</td><td></td></tr><tr><td>AIM V</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12055091</td><td></td></tr><tr><td>Sistema cromatográfico Acquity UPLC Classe H</td><td>Waters Co.</td><td>https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW</td><td></td></tr><tr><td>Condessa 3 FL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A49892</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>D 8418</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de vidro</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>41121800</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>PHCBI</td><td>MCO-50M-PE</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>41121702</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>PPB006</td><td></td></tr><tr><td>Speevac miVac</td><td>Fisher Scientific</td><td>56340</td><td></td></tr><tr><td>O software para aquisição de dados</td><td>Waters Co.</td><td>MassLynx</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa triplo quadrupolo Xevo TQ-S micro</td><td>Waters Co.</td><td>https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador Ultrassônico</td><td>Quimis</td><td>Q335D</td><td></td></tr><tr><td>Vinblastina 1 mg/mL</td><td>Libbs</td><td>https://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/</td><td>Vinblastina sulfato</td></tr><tr><td>Vincristine</td><td>Cayman Chemicals</td><td>11764</td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento e padronização de um micrométodo ex vivo para quantificação intracelular da vincristina em células primárias de all por lc-ms/ms

Development and Standardization of an Ex Vivo Micromethod for Intracellular Quantification of Vincristine in Primary ALL Cells by LC-MS/MS

Resultados cromatográficos representativos obtidos após ensaios de acumulação intracelular usando células primárias ALL PDX incubadas com VCR e VINB são mostrados na Figura 1. As amostras foram preparadas usando 2,5 × 106 células por condição. Sob as condições cromatográficas descritas, o VCR foi consistentemente retido em 2,85 min com efeito matricial mínimo, e a forma máxima foi simétrica e bem resolvida. Esses perfis ilustram o comportamento cromatográfico esperado de VCR e VIN...

Desenvolvimento e Padronização de um Micrométodo Ex Vivo para Quantificação Intracelular da Vincristina em Células Primárias de ALL por LC-MS/MS

Quantifying intracellular vincristine (VCR) in primary pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) cells is essential for understanding sample-specific ...

Nosso objetivo é medir vincristina intracelular em amostras clinicamente relevantes e investigar interações com células medicamentosas. O desafio experimental atual é otimizar o tempo de incubação entre os modelos. Além disso, a acomodação de medicamentos dependentes de modelos limita a robustez, especialmente em amostras primárias de pacientes.Para começar, descongele a amostra de células crioppreservadas girando suavemente o frasco em um béquer contendo 15 mililitros de água destilada a 37 graus Celsius até que o conteúdo esteja totalmente descongelado. Transfira o conteúdo do frasco para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 15 mililitros de PBS 1X estéril usando uma pipeta Pasteur descartável e estéril. Coloque o tubo na centrífuga ajustado a 300G por cinco minutos em temperatura ambiente.Após a centrifugação, descarte o sobrenadante invertendo o tubo em um único movimento suave. Agora, re-suspenda o pellet celular em 10 mililitros de AIM V Medium usando uma pipeta Pasteur descartável. Conte células viáveis usando um contador automatizado e meça o tamanho médio da célula.Calcule o volume necessário para obter 2,5 vezes 10 elevado à potência de seis células viáveis usando uma proporção simples baseada na concentração da célula medida. Faça um vórtice na solução de vincristina bem antes do uso. Adicione o AIM V Medium a um microtubo de dois mililitros, seguido de 2,5 vezes 10 à potência de seis células, e então adicione o volume necessário de solução de vincristina.Faça um vórtice breve e gire o tubo por cinco segundos para coletar líquido da tampa. Em seguida, incube os microtubos abertos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três horas. Após a incubação, feche as tampas dos tubos e centrifuge as amostras a 300G por cinco minutos em temperatura ambiente.Descarte cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta. Depois, adicione um mililitro de PBS em temperatura ambiente ao tubo. Após repetir as etapas de centrifugação e lavagem, remova cuidadosamente todo o sobrenadante restante usando uma pipeta.re-suspenda o pellet em 100 microlitros de PBS e vórtice até que o pellet esteja totalmente ressuspenso. Agora, adicione 400 microlitros de metanol frio contendo 0,1 micromolar vinblastina a menos 20 graus Celsius diretamente à amostra, evitando contato com as paredes do tubo. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius durante a noite.Pré-resfrie a centrífuga a quatro graus Celsius antes de retirar as amostras do freezer a menos 80 graus Celsius. Imediatamente após retirar as amostras do freezer, centrifuge-as a 13.000G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Depois, transfira 300 microlitros do sobrenadante para um microtubo de 1,5 mililitro usando uma pipeta.Seque completamente as amostras colocando-as em um concentrador a vácuo ajustado a 45 graus Celsius por uma hora e 40 minutos. Após a secagem, resuspenda cada pellet em 400 microlitros de água contendo 0,1% de ácido fórmico usando uma pipeta. Faça vórtice suavemente até que o pellet esteja totalmente dissolvido.Agora, centrifuge as amostras novamente a 13.000G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Transfira 300 microlitros do sobrenadante para um frasco de dois mililitros com tampa roscada para análise de cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem. Na tela inicial do software, abra a lista de amostras e crie uma nova lista digitando os nomes das amostras, volumes de injeção, posições dos frascos e o método a ser utilizado.Coloque um frasco contendo água ultrapura na bandeja do autoamostrador e designe esse frasco como um espaço em branco na lista de amostras. Faça o teste entre cada conjunto de injeções triplicadas para evitar retenções. Selecione as linhas desejadas na lista de exemplos e comece a aquisição de dados clicando em executar e confirmando com OK. Após a execução, selecione uma amostra dos resultados e visualize os cromatogramas clicando em cromatograma na barra de menu superior.Por fim, na tela inicial, clique em links de alvo. Selecione os arquivos que acabaram de rodar e clique em processar. Selecione o método vincristina e clique em OK para gerar tabelas de saída.A análise cromatográfica de células xenoenxertas derivadas de pacientes derivadas de leucemia linfoblástica aguda primária, incubadas com um micromolar vincristina por três horas, mostrou consistentemente um pico simétrico e bem resolvido do VCR aos 2,85 minutos, confirmando retenção adequada e interferência mínima na matriz. Curvas de calibração para vincristina geradas em meios AIM V mostraram forte linearidade entre concentrações de 0,001 a 10 micromolares. De forma semelhante, quando duas vezes 10 elevado à potência de seis RS4; 11 células foram adicionadas, observando-se uma resposta linear de 0,01 a um micromolar.A análise do curso temporal do acúmulo de vincristina revelou que RS4; 11 células apresentaram um platô na razão vincristina por vinblastina entre duas e três horas, com um aumento modesto entre quatro e cinco horas, enquanto as células primárias de PDX atingiram o pico em duas horas e declinaram depois, apoiando a seleção de três horas como um tempo de incubação equilibrado. O acúmulo normalizado de vincristina variou em seis amostras de pacientes com PDX e foi observada uma correlação positiva entre as razões não normalizadas de vincristina por vinblastina e o volume médio das células. A análise de fragmentação confirmou que o pico base da vincristina correspondia ao íon precursor na razão de carga mestre 413,38, que gerou um íon de quantificação em 392,47 e um íon de confirmação em 383,38 sob 40 volts de energia cone e 16 volts de energia de colisão.Nosso protocolo supera limitações das abordagens indiretas ao possibilitar a medição intracelular direta e sensível de fármacos em células principalmente leucemias. Nossa abordagem facilita a medição direta da vincristina intracelular, mesmo que os votos celulares sejam baixos. No futuro, investigaremos se diferenças no acúmulo intracelular de fármacos estão associadas à resistência in vitro e exploraremos mecanismos relacionados.

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Pesquisa sobre o Câncer

Descreve-se um método para controlar a ruptura endomembranar provocada pelas bactérias...

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Competência metabólica de sistemas in vitro é um requisito chave para a biotransformação e disposição de drogas e substâncias tóxicas. Neste protocolo, descrevemos a aplicação de sondas metabólicas referência para avaliar metabolismo de fase I em culturas de células.

Espectrometria de Massa e abordagens baseadas no Luminogenic Caracterizar Fase I Metabolic Competência de<em&gt; In Vitro</em&gt; culturas de células

Aqui, a citometria de fluxo de imagem multiespectral com uma característica analítica que compara imagens de detalhes brilhantes de 3 marcadores de autofagia e quantifica sua co-localização, juntamente com a contagem de pontos LC3, foi usada para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Uma plataforma integrada da manipulação da pilha é desenvolvida para o uso conjuntamente com uma instalação de espectrometria maciça da único-ponta de prova para a análise em linha de pilhas individuais da suspensão circunstâncias ambientais.

Plataforma integrada da manipulação da pilha acoplada com a único-ponta de prova para a análise da espectrometria maciça das drogas e dos metabolitos em únicas pilhas da suspensão

Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.

Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

Este manuscrito descreve como avaliar a imunogenicidade in vivo de vesículas extracelulares derivadas de células tumorais (EVs) usando citometria de fluxo. Os EVs derivados de tumores submetidos à morte de células imunogênicas induzidas pelo tratamento parecem particularmente relevantes na imunossuperveiência tumoral. Este protocolo exemplifica a avaliação dos EVs de tumor imunoestimulatório induzidos por oxaliplatina, mas pode ser adaptado a várias configurações.

In vivo Triagem de imunogenicidade de vesículas extracelulares derivadas do tumor por citometria de fluxo de células T esplênicas

Vesículos extracelulares (EVs) contribuem para a biologia celular e comunicações intercelulares. Há necessidade de ensaios práticos para visualizar e quantificar a absorção de EVs pelas células. O protocolo atual propõe o ensaio de absorção de EV utilizando imagens de fluorescência tridimensional através de microscopia confocal, após o isolamento do EV por um dispositivo microfluido baseado em nanofilição.

Ensaio de absorção de vesícula extracelular via análise de imagens de microscópio confocal

Aqui, apresentamos um protocolo para medir metabólitos de forma precisa e confiável em tipos celulares raros. Melhorias técnicas, incluindo um fluido de bainha modificado para a triagem celular e a geração de amostras em branco relevantes, permitem uma quantificação abrangente de metabolitos com uma entrada de apenas 5000 células por amostra.

Metabolômica direcionada em células primárias raras

Este protocolo descreve o isolamento de pequenas vesículas extracelulares de músculos esqueléticos murinos e medula óssea usando digestão enzimática e cromatografia de exclusão de tamanho, permitindo a recuperação reprodutível de frações enriquecidas com vesículas de tecidos estruturalmente complexos e de baixo rendimento para análise molecular posterior.

Isolamento de Pequenas Vesículas Extracelulares do Músculo Esquelético Murino e Medula Óssea por Cromatografia de Exclusão de Tamanho

Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Aprenda a desenvolver um método LC-MS/MS para quantificar a acumulação intracelular de vincristina em células primárias de leucemia linfoblástica aguda pediátrica. Esta abordagem validada melhora o monitoramento terapêutico clínico.

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Desenvolvimento e Padronização de um Micrométodo Ex Vivo para Quantificação Intracelular da Vincristina em Células Primárias de ALL por LC-MS/MS

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