Name: Patologia Estriatal Induzida por Lentiviral como Modelo Pré-clínico de Ataxias Espinocerebelosas de Poliglutamina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo lentiviral estriatal para estudar ataxias espinocerebelares de poliglutamina, recapitulando agregados intraneuronais e perda de marcadores neuronais em camundongos C57BL6J.

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<ol><li>Afonso-Reis, R., Afonso, I. T., Nóbrega, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Status+of+Gene+Therapy+Research+in+Polyglutamine+Spinocerebellar+Ataxias%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Current Status of Gene Therapy Research in Polyglutamine Spinocerebellar Ataxias.</a> Int J Mol Sci. 22 (8), 4249(2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.9% NaCl</td><td>Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Usado para preparação de misturas de anestesia e antagonistas</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecido de 100 mm</td><td>SPL Life Sciences</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>Kit ABC (Complexo Avidina-Biotina)</td><td>VECTASTAIN Elite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole (5,0 mg/mL)</td><td>Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Antagonista da medetomidina</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de biossegurança, Classe II (compatível com BSL-2)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário biotinilado</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Álbumina Sérica Bovina (BSA)</td><td>NZYTech</td><td>MB47002</td><td></td></tr><tr><td>Secções cerebrais (por exemplo, secções coronárias de 30&ndash;40 &micro;m) imunomarcadas para DARPP-32</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Plugin Contador de Células (FIJI)</td><td>Construído / ImageJ</td><td>&mdash;</td><td>Ferramenta para contagem manual de agregados</td></tr><tr><td>Incubadora CO2 (37 &deg;C, 5% CO2, umidificado)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Estação de trabalho de computador</td><td>Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Usado para processamento de imagem e execução de software</td></tr><tr><td>Tubo cônico para ultracentrifugação</td><td>Beckman Coulter</td><td>358126</td><td></td></tr><tr><td>Algodão</td><td>Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Usado para remoção do periósteo</td></tr><tr><td>Criostato com suporte para disco de espécime</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DAB (Diaminobenzidina)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de coordenadas estereotáxicas digital</td><td>Stoelting/WPI</td><td>51725</td><td>Display digital para medição de coordenadas</td></tr><tr><td>Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, glicose alta)</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>11-965-092</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico 70, 96 e 100%</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico, 70%</td><td>Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Para desinfecção do couro cabeludo</td></tr><tr><td>Fentanil (0,05 mg/mL)</td><td>Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Componente anestésico</td></tr><tr><td>Soro Bovinote Fetal (FBS), desativado por calor</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>FIJI (distribuição ImageJ)</td><td>NIH / ImageJ</td><td>https://fiji.sc/</td><td>Software de código aberto para quantificação manual de agregados</td></tr><tr><td>Pinça fina (para pinça do dedo)</td><td>Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Para monitoramento da profundidade da anestesia</td></tr><tr><td>Flumazenil (0,1 mg/mL)</td><td>Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Antagonista do midazolam</td></tr><tr><td>Pinça e bisturi</td><td>Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Para remoção do periósteo e exposição do crânio</td></tr><tr><td>Seringas Microlitro/Gastight Hamilton Série 700/1700</td><td>Hamilton / Fisher Sci.</td><td>7653-01/10550203</td><td>Para carregamento de solução viral</td></tr><tr><td>Agulhas removíveis com HUB pequeno Hamilton (26G)</td><td>Hamilton / Fisher Sci.</td><td>7804-03/ 10698205</td><td>Para entrega viral</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento (para roedores)</td><td>Kent Scientific / SOMNI</td><td>por ex. 04-777-177</td><td>Para manter a temperatura corporal</td></tr><tr><td>Células HEK 293T (&le; passagem 10, livre de micoplasma)</td><td>ATCC ou equivalente</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Software IHCAggreCount</td><td>Fornecido sob demanda</td><td>N/A</td><td>Software proprietário interno para detecção e quantificação semiautomatizada de agregados</td></tr><tr><td>Microscópio invertido (para confluência celular)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de laboratório</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Vetores lentivirais (WT e mutantes)</td><td>In-house / Instalação central</td><td>N/A</td><td>Solução viral para injeção</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz com câmera (campo brilhante)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidina (1,0 mg/mL)</td><td>Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Componente anestésico</td></tr><tr><td>Microbroca (compatível com estereotáxico)</td><td>Stoelting / Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Para craniotomia</td></tr><tr><td>Bomba de microinjeção (por exemplo, Stoelting)</td><td>Stoelting/WPI</td><td>53210</td><td>Bomba de infusão automatizada para injeções virais</td></tr><tr><td>Micropipeta (P1000, P200, P10) e pontas</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Imagens de microscopia (secções IHC)</td><td>Gerado internamente</td><td>N/A</td><td>Imagens de imunohistoquímica a serem analisadas</td></tr><tr><td>Lâminas de microtomo (baixa perfil, descartáveis)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam (5,0 mg/mL)</td><td>Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Componente anestésico</td></tr><tr><td>Meio de montagem</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Naloxona (0,4 mg/mL)</td><td>Fornecedor local</td><td>&mdash;</td><td>Antagonista do fentanil</td></tr><tr><td>Suporte de agulhas e agulhas de dissecação fina</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal (NGS)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Composto O.C.T.</td><td>Tissue-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica (Bepanthen Eye and Nose Ointment, 5% Dexpanthenol)</td><td>Bayer</td><td>11568-0053</td><td>Previne a secagem da córnea durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Misturador orbital</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA p24</td><td>ZeptoMetrix</td><td>0801111</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PBS sem Ca2+/Mg2+, pH 7,0</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>10-010-031</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12263</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (100&times;)</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Fenilidrazina</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #1

patologia estriatal induzida por lentiviral como modelo pré-clínico de ataxias espinocerebelosas de poliglutamina

Lentiviral-Induced Striatal Pathology as a Preclinical Model of Polyglutamine Spinocerebellar Ataxias

Patologia Estriatal Induzida por Lentiviral como Modelo Pré-clínico de Ataxias Espinocerebelosas de Poliglutamina

Polyglutamine spinocerebellar ataxias are a group of six neurodegenerative diseases caused by a mutation in the trinucleotide CAG tract within the coding ...

lentiviral-induced-striatal-pathology-as-preclinical-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um protocolo para a quantificação rápida e sensível da gravidade da doença em ratos de ataxia cerebelar. Medidas incluem membro posterior segurando, borda teste de marcha, e cifose. Este protocolo efetivamente discrimina entre os indivíduos afetados e não afetados, e detecta a progressão dos indivíduos afetados ao longo do tempo.

Um sistema simples de pontuação Composite Fenótipo para avaliar modelos de ratos de ataxia cerebelar

Fonte: Tagliafierro, L., et al. Plataforma de vetor lentiviral para a entrega eficiente de ferramentas de edição de epigenoma em modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a transdução lentiviral de células progenitoras neurais (NPCs) para modificação epigenética direcionada da alfa-sinucleína, uma proteína-chave na doença de Parkinson. O protocolo permite a metilação do DNA mediada por metiltransferase, reduzindo...

Transdução lentiviral de células progenitoras neurais para regulação epigenética da expressão de alfa-sinucleína

Apresentamos um protocolo bioquímico e comportamental para avaliar a eficácia de compostos solúveis em água direcionados às mitocôndrias para o tratamento da ataxia espinocerebelar tipo 1 (SCA1) e outras doenças neurodegenerativas cerebelares.

Tratar ratos SCA1 com solúvel em água compostos não especificamente impulsionar a função mitocondrial

O objetivo do presente protocolo é fornecer um sistema celular que Replica a formação do alfa-synuclein agrega na vivo. Inclusões intracelulares alfa-synuclein são semeados nos neurônios primários pela internalização e propagação de exógeno administrado agregados nativo associado microssomas alfa-synuclein, isolados de ratos transgênicos doentes alfa-synuclein.

Administração exógena de agregados de microssomas associados alfa-synuclein para os neurônios primários como um modelo de célula poderosos de formação de fibrilas

O objetivo desta técnica é preparar uma cultura altamente enriquecida de motoneurônios primários (MNs) de murino da medula espinhal. Para avaliar as consequências das mutações causadoras de doenças MN, descrevemos aqui o isolamento destes isolados MNs e seu transfeccao por magnetofection.

Doença de Charcot-Marie-Tooth In Vitro de modelagem por Transfecting Mouse motoneurônios primários

Este protocolo detalha um procedimento em que as culturas neuronal humanas são transadas com construções lentivirais que codificam para o Tau humano do mutante. As culturas transadas exibem agregados Tau e patologias associadas.

Um modelo in vitro para estudar a agregação Tau usando transdução mediada por Lentivirus de neurônios humanos

Diferentes regiões cerebelares foram implicadas a desempenhar um papel em distintas saídas comportamentais, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos. Este trabalho descreve um método para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida o córtex cerebelar dos hemisférios, regiões anteriores e posteriores dos vermímis, e os núcleos cerebelares profundos, a fim de sondar as diferenças moleculares isolando o RNA e testando diferenças na expressão genética.

Dissecção Regional Cerebelr para Análise Molecular

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar as atividades neuroprotetoras de compostos de teste em Caenorhabditis elegans, incluindo agregação de poliglutamina, morte neuronal e comportamento de quimioavoidance, bem como uma integração exemplar de fenômenos múltiplos.

Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra neurotoxicidade mediada por poliglutamina

Este trabalho analisa a dose vetorial e o tempo de exposição necessários para induzir neuroinflamação, neurodegeneração e comprometimento motor neste modelo pré-clínico da doença de Parkinson. Esses vetores que codificam a α-sinucleína humana são entregues na substantia nigra para recapitular a patologia da sinucleína associada à doença de Parkinson.

Analisando o modelo de rato da doença de Parkinson induzida por vetores virais associados à Adeno codificando α-sinucleína humana

Aprenda a desenvolver um modelo lentiviral estriatal para estudar ataxias espinocerebelares de poliglutamina, recapitulando agregados intraneuronais e perda de marcadores neuronais em camundongos C57BL6J.

Patologia Estriatal Induzida por Lentiviral como Modelo Pré-clínico de Ataxias Espinocerebelosas de Poliglutamina

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