Ensaio de Perfil de Trombo: Uma Plataforma Baseada em Microfluídica para Caracterização Abrangente da Trombogênese Biomecânica

Desenvolvemos um novo método que pode capturar adequadamente os atributos biomecânicos da trombose e também detectar anormalidades protrombóticas em humanos. Para começar, use uma pastilha de silício para fabricar um molde mestre fotorresistente SU8 via fotolitografia padrão baseada no projeto e fixe o molde mestre no fundo de uma placa de Petri de 15 centímetros com fita. Prepare a mistura de polidimetilsiloxano, ou PDMS, misturando a base pré-polimérica e o agente de cura do kit de elastoméro de silicone em uma proporção de peso de 10 para 1.

Despeje a mistura de PDMS sobre o molde mestre. Depois, coloque a placa contendo a mistura de PDMS em um dessecador a vácuo para desgasificá-la. Cure termicamente a mistura de PDMS colocando-a em uma incubadora ajustada a 75 graus Celsius por duas horas.

Após remover a amostra da incubadora, corte cuidadosamente o PDMS curado do molde mestre e separa o PDMS curado em unidades individuais de chip. Usando uma agulha de sonda, perfure os furos nos locais designados para criar a entrada e a saída. Em um exaustor químico, use um lenço umedecido com 75% de etanol para limpar as lâminas de vidro e secá-las.

Em seguida, usando um gerador de alta frequência, trate os slides de vidro por 30 segundos e os chips PDMS por 20 segundos. Alinhe cada lasca com um slide de vidro e pressione suavemente o chip sobre a superfície do slide de vidro para prendê-la. Agora ligue termicamente os dispositivos colocando-os em um forno ajustado a 150 graus Celsius por 15 minutos.

Após a colagem, armazene os dispositivos em temperatura ambiente em condições livres de poeira. Depois, usando uma pinça, remova a parte plástica das agulhas da sonda e dobre os tubos metálicos a 90 graus para criar conectores para os dispositivos microfluídicos. Após preparar as reações para conjugar fibrinogênio e anticorpos necessários com Alexa Fluor, centrifuge as colunas de purificação a 1.100 G por dois minutos para remover o tampão de armazenamento.

Após descartar o fluxo, carregue a solução de reação na coluna de purificação montada em um frasco de coleta compatível e centrifuge a 1,100 G por cinco minutos para colher a mistura necessária. Usando um espectrofotômetro, meça a absorvância da proteína e do sinal do corante. Calcule a concentração de proteína e a razão molar fluorescência-proteína.

Armazene os corantes a quatro graus Celsius no escuro. Adicione heparina ao tampão de tirode a uma concentração final de 0,32 unidades por mililitro a cada 10 mililitros de sangue a ser coletado e prepare a seringa aspirando 500 microlitros de tampão de tirode no pH 7,4. Após coletar o sangue por vena na seringa contendo heparina, transfira-o para um tubo centrífugo de 15 mililitros e mantenha-o a 37 graus Celsius.

Dilua o monômero do fator de Von Willebrand para dois microgramas por mililitro no PBS. Pré-recubra os dispositivos microfluídicos com o monômero fator de von Willebrand diluído e incube-os por uma hora à temperatura ambiente. Agora incube a amostra de sangue com o sensor fluorescente em configuração 1 ou 2 por 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, conecte um dispositivo microfluídico com conectores de entrada e saída e tubulação. Conecte a outra extremidade do conector de entrada ao tubo contendo PBS e depois conecte a outra extremidade do conector da tomada a uma seringa. Monte a seringa em uma bomba de seringa e o dispositivo microfluídico em um microscópio invertido.

Manobre manualmente o estágio do microscópio para localizar o local da estenose. Encha o canal microfluídico e o tubo com PBS usando a bomba de seringa a uma vazão de 0,5 mililitros por minuto. Inspecione o dispositivo para garantir que não haja bolhas de ar ao redor do local da estenose.

Conecte o tubo de entrada à amostra de sangue e perfunda a amostra pelo canal microfluídico usando a bomba de seringa a uma vazão de 0,018 mililitros por minuto. Em um microscópio invertido, defina o tempo de exposição e o ganho para cada canal de fluorescência no software. Realize imagens de fluorescência multicolorida em tempo real alternando entre os quatro canais e excitando um fluoro-4 de cada vez.

Ajuste o plano de foco para o trombo e registre sinais fluorescentes no local da estenose por 15 a 30 minutos. Para análise de dados, abra o arquivo de dados usando a versão 1.53 do ImageJ. Use o canal C de ajuste SZ 22 para identificar o contorno do trombo.

Depois, usando seleções de polígonos, selecione aproximadamente a área do trombo. Para cada canal, elimine o sinal de fundo selecionando imagem, escolhendo Ajustar e depois selecionando Threshold. Por fim, meça a área e a intensidade média do sinal dentro do trombo selecionando Analisar e escolhendo Medida.

Instantâneos representativos mostraram trombones formados em sangue saudável dentro do canal estenótico, com plaquetas, fibrinogênio, fator von Willebrand e P-selectina visualizados usando o conjunto de sensores 1, e plaquetas, fosfatidilserina, integrina alfa IIb beta beta 3 E-positiva, uma integrina alfa IIb beta 3 ativada visualizada usando o conjunto de sensores 2. Uma única imagem de canal de fluorescência foi processada selecionando a área do trombo, removendo o sinal de fundo e medindo a área do sinal e o brilho médio para permitir a análise quantitativa. A análise contínua da intensidade do sinal fluorescente ao longo do tempo gerou uma curva de sinal em função do tempo para o acúmulo de plaquetas durante a formação do trombo.

Para cada ponto de tempo, foram obtidas intensidades totais de sinal para quatro biomarcadores no conjunto de sensores um e quatro biomarcadores no conjunto de sensores dois. O tamanho do trombo foi calculado e um perfil de trombo em sete dimensões foi gerado. Atualmente, não há ensaio biológico disponível para avaliar a tendência protrombótica dos pacientes humanos, e nosso trabalho busca preencher essa lacuna.

Ao detectar a atividade biomecânica das amostras de sangue, nosso ensaio pode avaliar de forma abrangente os atributos protrombóticos dos sujeitos. Nosso ensaio pode ser desenvolvido como um teste clínico para detectar tendência protrombótica em pacientes, e também pode ser usado para triagem de medicamentos antitrombóticos de próxima geração.