Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos
10 de abril de 2026
Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.
Estudamos o desenvolvimento do pâncreas endócrino humano usando ilhós derivados de células-tronco para entender a base genética do diabetes. O transplante tradicional de cápsulas renais é altamente invasivo. O protocolo de transplante intramuscular oferece uma alternativa mais simples, reproduzível e minimamente invasiva.
Para começar, adicione 0,5 mililitros de solução antiaderente a 5% para cobrir o fundo de uma placa de micropoços de 24 poços contendo micropoços piramidais invertidos. Centrifuge a placa a 1.300 g por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois, examine os micropoços ao microscópio em busca de bolhas de ar.
Após recentrifugar a placa, para remover qualquer ar preso, aspire a solução antiaderente. Depois, lave cada poço com 0,5 mililitros de PBS e repita a etapa de lavagem mais uma vez. Em seguida, lave os progenitores pancreáticos cultivados desenvolvidos a partir de hPSCs com um mililitro de PBS com 0,5 milimolar de EDTA.
Aspire o PBS com 0,5 milimolar de EDTA e cubra os poços com tripsina. Depois, incube a 37 graus Celsius por oito a doze minutos. Dilua a tripsina com dois volumes de DMEM/F12 ou PBS e ressuspenda suavemente as células por pipeteamento.
Transfira a suspensão para um tubo cônico e imediatamente prossiga para a próxima etapa. Centrifuge a suspensão a 200 g por três minutos em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda delicadamente a bola em meio S4 pré-aquecido.
Em seguida, aspire o PBS das antenas micropoços. Adicione suavemente 1,25 mililitros das células suspensas a cada poço da placa do micropoço. Centrifuge a placa a 100 g por três minutos em temperatura ambiente para distribuir as células uniformemente nos micropoços.
Transfira cuidadosamente a placa do micropoço para uma incubadora umidificada. Para realizar mudanças no meio com meios diferenciadores, aspire suavemente e dispense o meio ao longo das paredes do poço para evitar turbulência e o deslocamento de agrupamentos celulares dos micropoços. Após transferir a quantidade apropriada de aglomerados gerados para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros, conecte a seringa ao conjunto do tubo da agulha e preencha-o com meio S7.
Aspire os aglomerados diretamente para o tubo da microcentrífuga. Dobre o tubo ao meio e insira a seção dobrada em uma ponta de pipeta de 200 microlitros. Depois, insira o conjunto da agulha do tubo da ponta em um tubo cônico de 15 mililitros e fixe as extremidades na borda do tubo usando fita.
Centrifuge o tubo a 100 g por dois minutos a 4 graus Celsius para compactar os aglomerados e imediatamente coloque o tubo no gelo. Para transplantar os aglomerados para os camundongos NOD scid anestesiados, raspe a parte medial da perna direita abaixo do joelho e desinfete com etanol a 70%. Depois, desconecte o tubo da ponta da pipeta e conecte-o à seringa.
Corte o tubo próximo aos cachos compactados e prenda-o na extremidade romba da agulha. Pressione o soro até que o primeiro aglomerado chegue à ponta da agulha. Depois, posicione o rato deitado, inclinando-se para o lado direito e estenda a perna direita.
Insira a agulha de quatro a cinco milímetros de profundidade no compartimento medial da coxa direita, entre os músculos adutor e grácil. Em seguida, injete os aglomerados enquanto retrai a agulha em aproximadamente três milímetros. Gire a seringa, retire a agulha e deixe o rato se recuperar.
Após a recuperação do enxerto seis semanas após o transplante e a secção do tecido, realize imunocoloração para possibilitar análises de imagem subsequentes. Suspensões de célula única dos progenitores pancreáticos do estágio quatro foram encaixadas em placas de micropoço para gerar agregados tridimensionais controlados por tamanho. Em 24 a 48 horas, compactos aglomerados esféricos se formaram.
A microscopia de fluorescência confirmou a presença de PDX1 e células expressoras de insulina em linhas de hPSC repórteres. Após seis semanas, o local do enxerto foi visualizado macroscopicamente com massas semelhantes a olhos identificáveis dentro do músculo. Após a excisão, os explantos foram identificados sob um microscópio estereoscópico como estruturas esféricas pálidas de laço.
A detecção robusta de células positivas para peptídeos C foi observada em animais transplantados. A coloração por insulina confirmou a presença de células humanas semelhantes a betas dentro do enxerto. Células positivas para glucagon e somatostatina foram detectadas, indicando preservação das populações de células alfa e delta.
Esse protocolo facilita ensaios funcionais in vivo e a avaliação da sobrevivência e maturação de enxertos humanos transplantados. A consideração mais importante é garantir a diferenciação de células-tronco de alta qualidade e o manuseio suave das células durante a formação dos aglomerados para maximizar a viabilidade e garantir uma boa sobrevivência celular. Esses modelos facilitam a investigação dos mecanismos genéticos subjacentes ao diabetes monogênico e à disfunção das células beta.
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Visão Geral
Este artigo do JoVE apresenta um protocolo detalhado para o transplante intramuscular de ilhotas pancreáticas derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) em camundongos imunodeficientes. O método oferece uma alternativa menos invasiva ao transplante na cápsula renal ou subcutâneo, permitindo acesso cirúrgico direto e recuperação confiável do enxerto. O protocolo permite a avaliação da função das ilhotas por meio da secreção de insulina estimulada pela glicose (GSIS) in vivo após um desafio oral com glicose e facilita análises histológicas posteriores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Medicina regenerativa
- Terapia com células-tronco
- Pesquisa sobre diabetes
Antecedentes
- Células endócrinas pancreáticas derivadas de hPSC têm potencial para terapia celular do diabetes e modelagem de doenças.
- Locais atuais de transplante, como a cápsula renal ou o espaço subcutâneo, apresentam limitações técnicas ou fisiológicas.
- A implantação in vivo é frequentemente necessária para estudar a maturação e a função de ilhotas derivadas de células-tronco em um contexto fisiológico.
- Existe a necessidade de locais de transplante reprodutíveis e acessíveis que permitam a recuperação do enxerto e a avaliação funcional.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para o transplante intramuscular de islotes derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) em camundongos imunodeficientes.
- Permitir a avaliação do enxerto, sobrevivência e função dos islotes em um local minimamente invasivo.
- Apoiar a avaliação funcional por meio de teste de liberação de insulina estimulada por glicose (GSIS) in vivo e análise histológica após o transplante.
- Estabelecer uma estrutura reprodutível para pesquisas pré-clínicas em diabetes utilizando islotes derivados de células-tronco.
Métodos Utilizados
- Preparação e compactação de agregados de ilhotas SC derivadas de hPSC pancreáticas.
- Cirurgia de transplante intramuscular em camundongos imunodeficientes.
- Avaliação da secreção in vivo de insulina estimulada por glicose (GSIS) após desafio oral com glicose.
- Recuperação do enxerto e análise histológica para avaliação pós-transplante.
Resultados Principais
- Enxerto bem-sucedido e sobrevivência de ilhotas derivadas de hPSCs no sítio de transplante intramuscular.
- Detecção de secreção funcional de insulina em resposta ao desafio com glicose por meio da GSIS in vivo.
- Recuperação confiável dos enxertos para análise histológica, confirmando a estrutura das ilhotas e a expressão de marcadores.
- Demonstração de um método reprodutível e minimamente invasivo para estudos pré-clínicos de transplante de ilhotas.
Conclusões
- O transplante intramuscular é um sítio viável e acessível para o enxerto de ilhotas derivadas de hPSC em camundongos.
- O procedimento permite a avaliação funcional de ilhotas derivadas de células-tronco por meio da GSIS in vivo.
- A recuperação do enxerto possibilita análises histológicas e moleculares abrangentes após o transplante.
- Este protocolo fornece um modelo pré-clínico reprodutível para o avanço da pesquisa em terapia celular para o diabetes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O transplante intramuscular de células endócrinas pancreáticas derivadas de células-tronco pluripotentes humanas fornece um modelo pré-clínico minimamente invasivo e reprodutível para o desenvolvimento da terapia celular do diabetes. Essa abordagem permite a avaliação funcional de ilhotas derivadas de células-tronco por meio da secreção de insulina estimulada por glicose in vivo e possibilita a recuperação confiável do enxerto para análises posteriores, superando limitações importantes dos sítios tradicionais de transplante. O método aumenta a confiabilidade preditiva da avaliação pré-clínica ao oferecer um contexto fisiológico para a maturação e função das ilhotas, ao mesmo tempo que melhora o acesso cirúrgico e reduz a invasividade nos animais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a avaliação da maturação funcional de ilhotas derivadas de células-tronco em um contexto fisiológico.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio do enxerto confiável e da secreção de insulina responsiva à glicose em camundongos imunodeficientes.
- Valor Estratégico: Facilita a confiança preditiva na validação de alvos ao fornecer leituras funcionais reprodutíveis antes da otimização do composto líder.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos posteriores, estabelecendo o enxerto funcional de ilhotas.
- Valor Operacional: Padroniza procedimentos de transplante para garantir reprodutibilidade e escalabilidade em estudos pré-clínicos.
- Valor Estratégico: Aprimora a prontidão do ensaio ao permitir saídas funcionais quantitativas por meio da SSIG in vivo para avaliação do efeito de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para a doença ao modelar a função de ilhotas humanas in vivo, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Valor Operacional: Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, com recuperação consistente do enxerto e análise histológica.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, fornecendo dados funcionais e estruturais sobre enxertia e maturação das ilhotas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta ao apoiar a verificação de hipóteses na fase inicial de descoberta, permitindo a padronização de ensaios para triagem e fornecendo leituras funcionais que orientam as decisões de identificação de compostos promissores e avanço pré-clínico.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao avaliar a função das ilhotas em um local fisiológico de transplante.
- Triagem: Aprimora a prontidão do ensaio por meio de transplante padronizado e medições reprodutíveis de secreção de insulina estimulada por glicose.
- Análises: Fornece medições quantitativas de variáveis dependentes por meio da ISGS in vivo para comparar a função do enxerto entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao permitir análises histológicas e moleculares dos enxertos recuperados para avaliação da maturação.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma pré-clínica reutilizável para ciclos iterativos de projeto e teste no desenvolvimento de terapias para diabetes baseadas em células-tronco.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista na função e maturação de ilhotas derivadas de células-tronco.
- Valor Operacional: Melhora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos procedimentos de transplante entre diferentes centros de pesquisa.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados funcionais confiáveis, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados dos programas de diabetes.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco por meio da enxertia reprodutível e validação funcional de ilhotas derivadas de células-tronco.
Considerações sobre a Implementação
- Exige especialização em diferenciação de células-tronco, técnicas de transplante microcirúrgico e testes metabólicos in vivo.
- Depende de infraestrutura cirúrgica estéril, sistemas de desafio à glicose e ensaios de detecção de insulina para leituras funcionais.
- Necessita padronização entre equipes distintas envolvendo processamento celular, cirurgia e análise, para garantir resultados consistentes.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes linhagens de camundongos imunodeficientes e cronogramas de maturação de ilhotas.
- É limitado pela necessidade de monitoramento pós-operatório e procedimentos de recuperação de enxertos, o que pode afetar a produtividade em estudos de grande escala.
