Procedimentos para a Identificação de Inibidores de Entrada do SARS-CoV-2 como Potenciais Antivirais Utilizando Pseudovírus Baseados em MLV

Nossa pesquisa foca na identificação de inibidores que bloqueiam a entrada do SARS-CoV-2 usando sistemas de pseudovírus. Estudar a entrada no SARS-CoV-2 frequentemente requer laboratórios de contenção de alta biossegurança, tipicamente BSL-3. Esse protocolo possibilita triagem antiviral segura usada em pseudovírus em laboratórios padrão de BSL-2.

Para começar, coloque uma placa de cultura de tecido de seis poços no gabinete de biossegurança e semeie 7,5 vezes 10 à potência de cinco células derivadas do HEK 293 por poço em dois mililitros de meio completo. Incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, confirme que as células atingiram aproximadamente 50 a 60% de confluência.

No dia seguinte, prepare a solução de polietilenemína ou de PEI adicionando cinco microlitros de um miligrama por mililitro de estoque de PEI a 50 microlitros de meio sérico reduzido em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Em um tubo microcentrífugo separado de 1,5 mililitro de 1,5 mililitros, prepare a solução de DNA adicionando 2,5 microgramas de plasmídeo que expressa GFP a 50 microlitros do mesmo meio. Misture cada tubo brevemente por vortex, depois gire para baixo por cinco segundos e incube em temperatura ambiente.

Durante o período de incubação de 10 minutos, remova cuidadosamente o meio de cada poço da placa de seis poços sem perturbar a monocamada celular e adicione um mililitro de meio de transfecção completo, sem antibióticos, a cada poço. Após a incubação, adicione 50 microlitros da solução de DNA ao tubo contendo a solução PEI. Misture rapidamente pipetando seis vezes e incube em temperatura ambiente por exatamente três minutos.

Depois, adicione rapidamente o complexo de DNA do PEI em gota ao poço correspondente. Agora, vede as bordas da placa com parafilme e centrifuge a 1000 G por 30 minutos em temperatura ambiente sem pausa, usando um rotor oscilante e um balde de placa. Após a centrifugação, remova suavemente o parafilme e incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três horas.

Depois, substitua suavemente o meio de transfecção em cada poço por dois mililitros de meio DMEM completo pré-aquecido. Incube as células transfectadas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas e avalie a eficiência da transfecção avaliando a expressão de GFP usando microscopia de fluorescência. A semente HEK 293T derivou células em duas placas de 6 poços, conforme demonstrado anteriormente.

Designe uma placa para geração de pseudovírus de pico de SARS-CoV-2 e a outra para pseudovírus VSVG. Prepare a mistura de transfecção e os complexos de DNA PEI no dia do experimento e incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação, remova cuidadosamente o meio de cada poço das placas dos seis poços sem perturbar a monocamada celular.

Adicione lentamente um mililitro de meio de transfecção completa pré-aquecido, sem antibióticos, em cada poço, permitindo que o meio escorra pela parede do poço. Adicione os complexos de transfecção preparados às células para transfectá-las, como demonstrado anteriormente. Após 48 horas de incubação pós-transfecção, recolha os supernadantes de cada poço em um tubo cônico estéril de 50 mililitros e centrifuge a 290 G por sete minutos a quatro graus Celsius.

Colete o sobrenadante livre de células e filtre através de uma unidade de filtro estéril de 0,45 micrômetro com tampa de polivinilideno e flúor. Prepare alíquotas de um mililitro do supernadante filtrado e armazene-as a menos 80 graus Celsius Semente, 2,5 vezes 10, à potência de quatro células HSI, uma linhagem celular altamente suscetível ao SARS-CoV-2, em 50 microlitros de DMEM completo por poço em uma placa de cultura de tecido com 96 poços. Prepare e rotule poços triplicados para cada condição a ser testada, incluindo infecção por pseudovírus sem faísca e controles não infectados.

Incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia da transdução, descongele uma aliquota de cada lote de pseudovírus no gelo e misture suavemente por inversão, incluindo uma aliquota do controle sem espinhos. Adicione os volumes necessários de preparação para pseudovírus diretamente aos poços designados.

Ajuste o volume de cada poço para 150 microlitros com DMEM completo. Agora, vede a placa com parafilme e centrifuge a 2.500 G por 45 minutos em temperatura ambiente sem pausa. Remova o selo do parafilme e incube a placa por 72 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Após a incubação, prepare os reagentes de ensaio de luciferase conforme as instruções do fabricante. Descongele o substrato de luciferase e o buffer de lise do ensaio 5X de luciferase em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Dilua o tampão de lise 5X do ensaio de luciferase para 1X com água estéril.

Aspire cuidadosamente e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 30 microlitros de buffer de lise 1X a cada poço. Coloque o prato sobre um agitador de pratos e agite por 10 minutos a 150 rotações por minuto em temperatura ambiente.

Verifique a lise celular completa sob um microscópio invertido para confirmar que as células estão totalmente lisadas e não distinguíveis. Depois, transfira os lisados para uma placa branca opaca de 96 poços. Adicione 50 microlitros de substrato de luciferase a cada poço.

Misture brevemente movendo a placa suavemente em um movimento circular, coloque a placa no luminômetro para medir a luminescência. Semente 2,5 vezes 10 à potência de quatro células HSI em 50 microlitros de DMEM completo por poço em uma placa de 96 poços, conforme descrito anteriormente. Incube durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

No dia seguinte, prepare-se uma a três diluições em série dos compostos a serem testados, como arbidol em DMEM completo contendo 0,5% de dimetil sulfóxido. Usando uma pipeta multicanal, aspire suavemente o meio de cada poço. Adicione 50 microlitros da diluição composta correspondente a cada poço enquanto adiciona DMEM completo sozinho aos poços de controle da coluna 12.

Incube por uma hora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Sem remover os compostos, adicione diretamente 50 microlitros do pseudovírus SARS-CoV-2 spike a cada poço diluído em meio completo contendo as mesmas concentrações de compostos. Sele a placa com parfilm.

Centrifuge a 2.500 G por 45 minutos em temperatura ambiente, sem pausa. Após remover o parfilme, incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Por fim, quantifique a infectividade usando um ensaio de luciferase, como demonstrado anteriormente.

A transfecção de células derivadas do HEK 293T com PEI ramificado resultou em alta eficiência de transfecção, resultando em cerca de 70% de células positivas para GFP. 48 horas após a transfecção. A infecção de células HSI suscetíveis com quantidades decrescentes de pseudovírus spike do SARS-CoV-2 ou pseudovírus VSVG apresentou um aumento dependente da dose na luminescência com o aumento da entrada de pseudovírus.

Pseudovírus sem espinhos e células não infectadas apresentaram níveis muito baixos de luminescência. O composto arbidol foi testado quanto à sua capacidade de inibir a entrada de pseudovírus e produziu uma clara inibição de resposta à dose da atividade da luciferase gerada por pseudovírus espinhos, com menor inibição observada nos pseudovírus VSVG. O ensaio mostrou um fator primo Z de 0,54, indicando adequação para fins de triagem.

O tratamento com arbidol em concentrações iniciadas em 30 micromolares não afetou significativamente a viabilidade celular em comparação com as células tratadas apenas com veículo de dimetil sulfóxido a 0,5%. Esse protocolo permitia a produção de pseudovírus de alto título por meio de condições otimizadas. Isso permite aos pesquisadores medir a entrada pseudoviral e identificar compostos que inibem a infecção mediada pelo pico de SARS-CoV-2.

Alta eficiência de transfecção é fundamental para gerar pseudovírus de alto título e obter sinais de infecção confiáveis em ensaios posteriores. Este sistema suporta a triagem antiviral de alto rendimento e a desvalorização de inibidores de entrada contra variantes emergentes do SARS-CoV-2, podendo ser facilmente adaptado para gerar pseudovírus exibindo proteínas de envelope de outros vírus.