Mapeamento genômico amplo de modificações histonas e sítios de ligação de fatores de transcrição em linhas celulares neuroendócrinas de câncer de pulmão de pequenas células usando CUT&RUN

Portanto, o objetivo da nossa pesquisa é identificar as interações entre fatores de transcrição que definem linhagem e proteínas de remodelação da cromatina nos diferentes tipos de câncer de pulmão de pequenas células, na regulação das paisagens de transcrição e como essas interações podem contribuir para processos da doença, incluindo o início e progressão do câncer. Nosso objetivo é alcançar isso conduzindo experimentos como o CUT&RUN, que é uma técnica de sequenciamento de próxima geração capaz de perfilar ou identificar em escala global as localizações genômicas onde essas histonas diferencialmente modificadas e fatores de transcrição ligados ao DNA. Em última análise, esperamos identificar novas vias que sejam reguladas epigeneticamente e que possam ser terapêuticas no desenvolvimento de novos tratamentos para pacientes com essa forma muito agressiva de câncer de pulmão.

Para começar, retire as células neuroendócrinas de câncer de pulmão de pequenas células cultivadas da incubadora a 37 graus Celsius e examine-as ao microscópio para garantir sua qualidade. Depois, transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 50 mililitros e centrifuge o tubo a 1.200 g por cinco minutos em temperatura ambiente. Aspire o meio do tubo cônico usando o vácuo do capuz e enxágue o pellet de células resultante com 20 mililitros de PBS.

Centrifuge o tubo novamente a 1.200 g por cinco minutos e aspire o PBS. Adicione Accutase conforme o tamanho do pellet e incube por três a cinco minutos a 37 graus Celsius para digerir o pellet celular. Em seguida, termine a digestão adicionando cinco mililitros de PBS com 10% de FBS e misturando para obter uma suspensão de célula única.

Após centrifugar as células novamente, como demonstrado anteriormente, resuspenda o pellet em cinco mililitros de PBS. Conte as células iniciais e confirme sua viabilidade e integridade usando o contador automático de células. Calcule o número total de células necessárias e adicione 20% de excesso para compensar erros de pipeteamento.

Transfira o número total calculado de células para tubos de 1,5 mililitro e centrifuge os tubos a 600 g por três minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda as células no buffer de lavagem a uma densidade de cinco vezes 10 para a potência de cinco células por reação, totalizando seis reações. Use 100 microlitros de tampão por reação e pipete suavemente, mas de forma cuidadosa, para garantir uma suspensão uniforme.

Centrifuge as células novamente, remova o sobrenadante e repita a lavagem. Aliquota 100 microlitros das células lavadas em cada tubo de um conjunto de oito tiras que contém 10 microlitros de esferas ativadas de Concanavalina A. Pipete suavemente para misturar o conteúdo.

Incube a pasta de células de esferas por 10 minutos em temperatura ambiente para permitir a ligação das células às esferas e rapidamente gire os tubos em uma mini centrífuga para coletar a polpa sem permitir que as contas se depositem. Coloque os tubos em um suporte de ímãs de 0,2 mililitro para tubos. Deixe a pasta se dissipar e faça uma pipete para remover o sobrenadante.

Depois, remova os tubos do ímã. Adicione imediatamente 50 microlitros de tampão de anticorpos gelados a cada reação e pipete suavemente para ressuspender as contas. Rotule os oito tubos de tira adequadamente.

Adicione 0,5 microgramas de cada um dos anticorpos H3K4me3, H3K4me1 e imunoglobulina G e 0,6 microgramas de anticorpo policlonal E2F7 de diferentes fontes em cada tubo de reação. Pipete suavemente para misturar o conteúdo de cada tubo de reação cuidadosamente e incubá-lo durante a noite em um nutador a quatro graus Celsius com as tampas dos tubos elevadas. Remova os oito tubos de tira do nutador e faça uma rápida rotação para coletar líquido no fundo de cada tubo.

Agora coloque os tubos no suporte magnético até a polpa passar. Depois, cuidadosamente pipetei para remover e descartar o sobrenadante. Mantendo os tubos no suporte magnético, lave cada tubo duas vezes com 200 microlitros de tampão de permeabilização de célula fria e use uma pipeta de múltiplos canais para remover o sobrenadante após cada lavagem.

Em seguida, remova os tubos do suporte magnético. Adicione imediatamente 50 microlitros de tampão permeável a células frias a cada reação e pipete suavemente para ressuspender as células e esferas. Depois, adicione 2,5 microlitros de proteína AG-micrococo nuclease a cada reação e misture bem pipetando suavemente.

Após uma incubação de 10 minutos em temperatura ambiente, faça uma rápida rotação dos tubos. Coloque-os de volta no suporte magnético até a pasta se dissipar, e então remova o sobrenadante. Após lavar as esferas duas vezes com o tampão de permeabilização de células frias, ressuspenda-as suavemente em 50 microlitros do tampão permeável à célula.

Enquanto mantém os tubos no gelo, adicione um microlitro de cloreto de cálcio de 100 milimolares a cada reação na tira de oito tubos da etapa anterior. Pipete suavemente para resuspender completamente as esferas e promover uma digestão eficiente. Incube os tubos em um nutator a quatro graus Celsius por duas horas, mantendo as tampas dos tubos elevadas durante toda a incubação.

Agora, em um novo tubo de 1,5 mililitros, prepare a mistura de buffer de parada combinando 33 microlitros de buffer de parada com um micrólitro de pico de escherichia coli no DNA a 0,5 nanograma por reação. Leve um vórtice para misturar a solução. Ao final da incubação de duas horas, adicione 33 microlitros da mistura tampão de parada preparada a cada tubo de reação e misture bem.

Incube os tubos de reação em um termociclador a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após uma rápida volta, coloque os tubos em um suporte de ímãs até que a solução fique clara. Transfira cuidadosamente aproximadamente 85 microlitros do sobrenadante contendo o DNA de liberação CUT&RUN para tubos frescos de 1,5 mililitro de cada um.

Purificar o DNA recuperado, avaliar sua quantidade e realizar a distribuição do tamanho dos fragmentos para controle de qualidade. Depois, prossiga com a preparação da biblioteca CUT&RUN, quantificação, pooling de bibliotecas indexadas e sequenciamento de próxima geração em pareados. Linhas celulares altas do homólogo do escudo aquete-1, DMS79 e H146, e linhas celulares altas do Fator de Diferenciação Neurogênica 1, H82 cresceu como agregados não aderentes ou esferoides compactos em suspensão, enquanto H446 apresentou morfologia mista, com aproximadamente 80% de células inerentes e 20% em suspensão.

A análise de fragmentos de DNA CUT&RUN revelou que a marca de histonas potenciadora H3K4me1 forneceu as maiores quantidades de DNA em todas as linhas celulares, seguida por H3K4me3, com E2F7 e IgG fornecendo as menores quantidades. Para o DNA extraído CUT&RUN, a distribuição do tamanho dos fragmentos para H3K4me1 e H3K4me3 mostrou picos claros para mononucleossomos e dinucleossomo, juntamente com DNA genômico. Em contraste, não foram detectados picos distintos para E2F7 ou para o controle IgG.

Apesar da baixa entrada de DNA, bibliotecas de sequenciamento de próxima geração foram construídas com sucesso para todos os alvos CUT&RUN, incluindo E2F7 e IgG. A análise de mapas de calor em células mutantes selvagens do tipo DMS79 e mutantes heterozigotas H146 mostrou que os sinais H3K4me3 e E2F7 estavam enriquecidos próximos aos locais iniciais da transcrição, enquanto os sinais H3K4me1 estavam mais amplamente distribuídos. A visualização do navegador genômico em uma região de cromatina selecionada aleatoriamente mostrou picos distintos para H3K4me3, H3K4me1 e E2F7, enquanto IgG não mostrou enriquecimento.

E assim, tradicionalmente, cientistas e pesquisadores usam imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento ou ChIP-seq para responder a perguntas como as que estamos fazendo. No entanto, o ChIP-seq requer uma quantidade relativamente alta de materiais de entrada, o que nem sempre é viável, dependendo do modelo utilizado. O CUT&RUN, por outro lado, requer significativamente menos material de entrada, com apenas 50.000 células, e requer leituras de sequenciamento de alto rendimento, o que significa que é menos custoso e produz muito menos background quando se trata de geração de dados.

O CUT&RUN é uma técnica que pode ser aplicada não apenas a células em cultura 2D, mas também para outros modelos pré-clínicos, como organoides derivados de pacientes e xenoenxertos. Também pode ser usado para perfilar a paisagem da cromatina em tecidos, incluindo tecidos normais e doentes. Portanto, essa é uma tecnologia ou técnica incrivelmente útil para pesquisadores de câncer, mas também pode ser muito útil para pesquisadores não relacionados ao câncer que estão focados em estudar diferentes doenças humanas.

Esse protocolo permite o mapeamento das modificações das histonas e dos perfis permanentes das diversas proteínas in situ no genoma celular. Fornecer PTMs de histonas e a ligação da TF entre subtipos de SCLC pode revelar genes direcionados específicos de subtipo e elementos regulatórios, como potenciadores e super-realçadores.