Validação do Sistema de Pressão Hiperbárica com Anestesia Xenônica para Drosophila melanogaster

Minha pesquisa busca entender como funciona a anestesia geral, e existem vários gases que são anestésicos em condições hiperbáricas. Esse protocolo nos permite anestesiar moscas-das-frutas com xenônio para estudar o mecanismo básico da anestesia geral. Para começar, colete 20 moscas anestesiadas fêmea e macho de Drosophila melanogaster, com idades de um a três dias, para cada experimento, e deixe-as descansar em um frasco com comida por pelo menos 24 horas antes do experimento, a uma temperatura de cerca de 22 graus Celsius.

Transfira os gases dos cilindros de gás dos recipientes para sacos à prova de vazamentos para uso experimental. Usando tubos de silicone, conecte diretamente a saída do cilindro de gás à entrada do saco de gás para permitir a transferência de gás. Conecte um tubo de silicone de 25 milímetros de comprimento a uma seringa de polipropileno.

Conecte a seringa de polipropileno aos sacos de gás e à torneira de três vias. Para montar o setup hiperbárico, primeiro posicione a mesa de luz LED em orientação paisagem sobre a mesa. Coloque a bomba de injeção ao lado de um lado curto da mesa de luz LED, posicionada de modo que a seringa experimental, quando colocada, se estenda acima da luz de fundo.

Agora, corte um tubo de silicone de 75 milímetros de comprimento. Conecte a torneira de três vias ao manômetro usando o tubo de silicone do bico central. Use grampos de mola no bico do lado do manômetro e a torneira de três direções na parte superior para garantir que o tubo esteja bem fixado.

Depois, use o botão marcado com uma seta dupla na unidade de controle da bomba de injeção para ajustar a velocidade para 80 milímetros por minuto e a duração para 38 segundos para compressão ou descompressão automática do êmbolo. Em seguida, limite a luz ambiente na sala de experimentos e ligue a mesa de luzes de LED. Ajuste o nível de brilho para três para aumentar o contraste do vídeo.

Remova o êmbolo da seringa de policarbonato. Insira uma pequena quantidade de algodão na ponta da seringa para evitar que a mosca escape. Para transferir 40 moscas para a seringa de policarbonato, remova a tampa do frasco, coloque o cano da seringa sobre o frasco, inverta o conjunto e toque para mover as moscas para dentro do corpo da seringa.

Oriente a seringa de modo que as marcas do cano fiquem voltadas para a câmera para visualização ótima das moscas. Fixe a seringa fixando tanto o cano quanto a cabeça do êmbolo à bomba de injeção usando parafusos ajustáveis. Agora, remova o algodão da ponta da seringa e conecte a seringa à torneira de três vias.

Comece a gravação do vídeo. Ligue o manômetro, depois vire o batente para conectar o manômetro à seringa e confirme pressão de quilopascal zero. Gire a torneira de três vias para a posição lateral para permitir a troca de ar com a seringa.

Usando a opção de controle manual da bomba de injeção, mova o êmbolo da marca de 20 mililitros para a marca de 2 mililitros. Aspire 18 mililitros de gás anestésico do saco de gás para a seringa de polipropileno. Conecte a seringa à porta lateral de trava de isca da torneira de três vias.

Depois, use a opção manual da bomba de injeção para mover o êmbolo de volta para a marca dos 20 mililitros. Gire o batente para conectar o manômetro à seringa e observe a leitura de pressão. Inicie o movimento automático do êmbolo com as configurações pré-definidas de velocidade e duração.

Deixe o êmbolo atingir a marca de cinco mililitros em 38 segundos enquanto monitora a pressão. Deixe o êmbolo na posição de cinco mililitros por 20 segundos e anote a pressão máxima. Bata suavemente na seringa para desalojar as moscas que estão aderindo ao êmbolo e deixe-as se acalmar no fundo.

Inicie a descompressão automática após 20 segundos. Encerre o experimento quando o êmbolo voltar à marca de 20 mililitros e registre a pressão final para controle do vazamento. Inicie o ScreenFlow para editar os vídeos.

Recorte cada vídeo gravado na região de interesse correspondente aos primeiros cinco mililitros do barril da seringa. Corte cada vídeo para os primeiros 20 segundos após a descompressão da seringa. Exporte os vídeos como GIFs e os duplique.

Agora, inicie o software Fiji para remover o primeiro e o último quadro de diferentes duplicados. Sequencialmente, clique em imagem, edição de vídeo e exclua os quadros. Clique em processar, binário, e transforme cada arquivo GIF em binário para que as moscas apareçam brancas sobre um fundo preto.

Abra ambos os arquivos binários em Fiji. Calcule a diferença de pixels entre eles selecionando o processo e o calculador de imagem para gerar um arquivo de diferença de pixels. Após salvar o arquivo de diferença de pixels, selecione analisar e analisar partículas, ajustando os limiares de tamanho dos pixels para melhorar a relação sinal-ruído.

Salve o arquivo CSV gerado contendo diferenças de pixels por quadro. Use os dados para calcular o movimento acumulado entre quadros para comparação estatística. Os vídeos experimentais foram processados convertendo-os em imagens binárias e de diferença para preparar a análise de pixels.

Sem limiar, as diferenças de pixels se acumularam ao longo dos quadros e elevaram o sinal de base para aproximadamente 20.000. Aplicar um limiar de tamanho de pixel de 100 a 1000 reduziu o sinal de fundo e enfatizou diferenças causadas pelo movimento da mosca. Os valores de diferença de pixels por quadro permaneceram próximos a zero antes do quadro 200.

O modelo YOLOv11 N rastreava moscas com alta precisão por quadro, mas oclusões frequentes levavam a atribuições excessivas de identificação de moscas. Devido a inconsistências no acompanhamento, o movimento da mosca foi quantificado somando todos os movimentos de ID por experimento e normalizando por um máximo de 200 IDs. Moscas expostas a 85% de xenônio se recuperavam mais rápido e se moviam mais do que aquelas expostas a 90% ou 95% de xenônio.

Nosso protocolo oferece simplicidade e rapidez, e utiliza materiais mais baratos do que câmaras de pressão tradicionais. A pressão máxima é limitada a aproximadamente quatro atmosferas, e vedação imperfeita causa perda gradual de pressão. Esse sistema permite medições reprodutíveis dos efeitos do gás anestésico no comportamento em pequenos organismos-modelo.