Localizada RNAi e Expressão Gênica ectópica na sanguessuga medicinal

O sanguessuga medicinal é um sistema modelo útil para estudos neurobiológicos devido à sua simplicidade, acessibilidade e à possibilidade de identificar neurônios estáticos com diversas ferramentas experimentais desde a embriogênese inicial até a velhice. Um uso particularmente interessante do embrião de sanguessuga é o estudo por imagens de lapso de tempo de projeções neuronais em animais intactos vivos, acompanhando modificações muito precisas da expressão gênica no neurônio em estudo ou em seus alvos. Neste vídeo, demonstramos uma nova tecnologia para entrega rápida, precisa e altamente localizada de reagentes nas camadas internas de embriões vivos de sanguessuga, utilizando uma pistola pneumática de capilar desenvolvida em colaboração entre o laboratório de Alex Grossman e o nosso laboratório.

Embora esta técnica possa ser aplicada à entrega de DNA ou RNA de fita dupla em qualquer outra molécula que possa ser carregada em partículas microscópicas de ouro, utilizaremos o método tanto para o silenciamento quanto para a inserção da molécula de orientação axonal Rin. Olá, sou do laboratório de Eduardo Ano, da Divisão de Ciências Biológicas da Universidade da Califórnia em San Diego. Hoje vamos mostrar um procedimento para reduzir ou aumentar a expressão da molécula de orientação axonal networking, que é naturalmente expressa na parede ventral do corpo, mas não no domínio dorsal de todos os segmentos corporais da lech.

Vamos introduzir moléculas de RNA de fita dupla ou DNA plasmidial na parede corporal e nos gânglios de segmentos selecionados em estágios iniciais de desenvolvimento. A entrega global por canhão pneumático de capilar é particularmente importante porque permite a perturbação dos padrões de expressão gênica em áreas selecionadas do subsegmento, mantendo os segmentos não tratados como controle interno. Além disso, pode ser utilizada para alcançar camadas internas de células em estágios iniciais de desenvolvimento sem danificar o tecido e sem abrir o espécime.

Por fim, a entrega holística apresenta a vantagem de poder direcionar um número limitado de células em uma localização selecionada, situando-se entre o bloqueio de célula única por microinjeção e o bloqueio sistêmico por abordagens genéticas. Então, vamos começar. O LE medicinal tem sido amplamente utilizado para estudar as propriedades de células nervosas e circuitos neurais relacionados ao comportamento, devido à simplicidade do sistema nervoso central, composto por cerca de 200 pares bilaterais de neurônios e um pequeno conjunto de glia gigante.

Cada gânglio segmentar dos 21 segmentos corporais, cada neurônio da sanguessuga pode ser repetidamente identificado e estudado de espécime para espécime, desde o embrião inicial até o adulto mais velho. Desde a época dos faraós, a sanguessuga tem sido usada com fins de sangria e seu uso contínuo na medicina a torna facilmente disponível por meio de fornecedores comerciais de animais. No entanto, como estudamos o desenvolvimento do sistema nervoso, mantemos em nosso laboratório uma colônia reprodutiva de sanguessugas, composta por várias centenas de indivíduos, o que nos fornece um suprimento constante de embriões para nossos experimentos.

As sanguessugas são hermafroditas. Elas possuem estruturas femininas e masculinas e se fertilizam cruzadamente. Portanto, todos os espécimes podem pôr ovos.

Eles fazem isso em uma estrutura chamada casulo, que eles mesmos fabricam utilizando um conjunto de glândulas especiais que excretam polímeros muito interessantes em uma região do corpo conhecida como clitelo. Quando pronta para pôr ovos, uma sanguessuga se enterra no musgo, que fornecemos nos tanques, e começa a formar esse casulo com formato de ovo ao redor de seu corpo; quando suficiente material foi excretado e as moléculas começaram a polimerizar, a sanguessuga deposita os ovos, bem como uma gema nutritiva no interior do casulo, e se retira dele. Usando uma lâmina de barbear, podemos remover os embriões cortando uma abertura na extremidade de um casulo.

Normalmente, cada casulo contém de 10 a 20 embriões a partir de cerca do sexto dia após iniciarem a diferenciação. Os embriões podem ser removidos do casulo e criados em água de lagoa. São nesses estágios que geralmente iniciamos nossos estudos experimentais sobre o desenvolvimento neuronal.

O primeiro passo importante neste procedimento é a preparação de partículas revestidas. Nesta demonstração, mostraremos como entregar partículas de ouro revestidas com moléculas de RNA de fita dupla do homólogo lech da molécula de orientação axonal rin em embriões de lech. As células-alvo são as células musculares longitudinais ventrais na parede corporal, que são conhecidas por expressar e liberar Rin a partir dos estágios iniciais da Agenesis.

Nosso objetivo é reduzir a expressão natural em um único segmento corporal o mais cedo possível durante o desenvolvimento e observar como isso afeta as categorizações de neurônios sensíveis a esse importante fator de desenvolvimento. Para esta etapa, são necessários o banho de sonicação, o vórtex, a centrífuga de bancada e o balde de gelo. Também é necessário isopropanol a 100%, que deve ser colocado em gelo antes do uso.

Inicie com 100 microlitros de tampão de ligação que contém 50 miligramas de partículas de vault por mililitro. Essas partículas são projetadas para RNAi e fabricadas pela empresa chell. Em seguida, dilua a solução de partículas adicionando 100 microlitros de tampão de ligação, vorte, brevemente, e sonique por um a dois minutos para separar as partículas que podem ter se aglomerado.

Após a sindicalização de dois minutos, adicione de cinco a 10 microgramas de RNA de fita dupla às partículas, vortexie e deixe em temperatura ambiente por dois minutos. Agora que os dois minutos terminaram, centrifugue os complexos de partículas de RNA de fita dupla no mínimo a 2.500 RPM na microcentrífuga por cerca de 15 segundos.

Para obter o pt, remova o sobrenadante e adicione 750 microlitros chamados de isopropanol com mínima perturbação do pellet. Centrifugue brevemente em microcentrífuga e remova o sobrenadante após a centrifugação, em seguida suspenda as partículas de ouro em isopropanol a 100% frio por meio de sonicação. Breve sonicação com dois a três pulsos no melhor sonicator para separar as partículas.

Despeje em uma lâmina de vidro e deixe o solvente evaporar completamente. Os melhores resultados são obtidos quando as partículas são revestidas logo antes da entrega ao tecido, o que mostraremos como fazer no próximo passo. Antes de realizar a transfeção balística, vamos examinar a configuração experimental e como prepará-la.

A pistola pneumática capilar é montada em um micromanipulador para a entrega precisa de partículas nos embriões. A superfície do embrião é visualizada com um microscópio de vídeo. Um laser de semicondutor gera um feixe de luz direcionado através do capilar interno da pistola e utilizado para mirar no tecido-alvo.

Linhas separadas de tubos Titan conectadas às três entradas da cabeça da pistola fornecem gás hélio pressurizado a partir de uma única fonte. Uma linha está sempre aberta, criando um fluxo contínuo de gás hélio através da pistola. Duas outras linhas normalmente estão fechadas com a válvula solenoide e contêm partículas de ouro com dois revestimentos diferentes que foram carregadas no tubo.

Como um pó seco. A capilaridade externa da pistola é conectada a um sistema de vácuo com uma pressão manométrica de menos 12,5 PSI. A pressão na cabeça do hi é variada entre 10 e 15 PSI para ajustar a profundidade desejada de penetração das partículas.

A pressão do hélio pode afetar significativamente a profundidade de penetração das partículas, assim como pode a distância entre o embrião e a arma. O diâmetro do bico, que varia entre diferentes armas de genes, é importante ser escolhido em relação à área-alvo. Agora que mostramos nossa configuração experimental, vamos carregar nossa arma Jing e disparar contra alguns embriões de lech.

Antes de carregar o tubo Titan, é fundamental que as partículas de ouro recobertas estejam completamente secas. As partículas de ouro recobertas são primeiramente raspadas das lâminas de vidro utilizando uma lamínula ou lâmina de barbear e estão prontas para serem carregadas no pedaço dobrado de papel manteiga. O tubo deve ser dobrado em formato de U próximo ao conector, de modo que as partículas não se espalhem por todo o tubo durante o carregamento, mas fiquem concentradas próximo ao conector.

Recolha as partículas com uma espátula pequena ou com um pedaço de papel de pesagem em forma de V e carregue o tubo. Toque levemente o tubo com o dedo durante o carregamento para distribuir as partículas uniformemente. Após carregar o tubo, podemos agora passar à entrega do RNA de fita dupla com a pistola Jing, mas não antes de prepararmos nossas sanguessugas.

Aqui você pode ver nossos embriões de sanguessuga, que têm aproximadamente 10 dias de idade. Eles estão agora em meio estéril, no qual serão mantidos tanto antes quanto após a entrega de RNA de fita dupla. O primeiro passo no preparo dos embriões experimentais para a entrega de RNA de fita dupla é adicionar uma solução de 8% de etanol em meio estéril a um pedaço plano de silicone flexível com um sulco em forma de V.

Um embrião é adicionado e posicionado com a face ventral voltada para cima imediatamente antes do disparo das partículas. O meio na câmara é reduzido até ficar logo abaixo da superfície superior do embrião, e um pedaço de papel de filtro com um pequeno orifício cortado no centro é colocado sobre ele para estabilizá-lo e evitar que sua superfície seque, ao mesmo tempo em que expõe apenas a área que será alvejada no estágio embrionário que estamos utilizando hoje. No estágio E 10, as células musculares longitudinais podem ser localizadas a cerca de 10 a 20 micrômetros da superfície externa, internamente em relação à epiderme, derme e músculos circulares.

Diferentemente das células musculares, os gânglios centrais na face ventral dos embriões nas fases embrionárias com as quais trabalhamos, de E sete a E 12, estão localizados a cerca de 50 micrômetros de profundidade em relação à superfície ventral do corpo. Ajustaremos a pressão de hélio para que possamos direcionar os músculos longitudinais, que se encontram a uma profundidade mais superficial do que os gânglios. Agora estamos prontos para bombardear os músculos longitudinais com partículas de ouro.

Uma carga de partículas de ouro com peso de aproximadamente meio miligrama normalmente pode ser usada para até 10 disparos, sendo que um único disparo geralmente libera cerca de algumas centenas de partículas. Um disparo é gerado pela abertura breve de uma das válvulas por 0,3 segundos, provocando a injeção de um bolo de partículas da linha de tubulação correspondente para dentro do cano da arma. Para cobrir a área de tecido de interesse, muitas vezes são necessários múltiplos disparos.

O tubo é levemente batido entre disparos para soltar algumas partículas e facilitar sua injeção no fluxo contínuo de hélio no interior do cano da arma. Se desejar administrar um segundo reagente no mesmo ensaio, você pode carregar partículas alternativas em um segundo tubo imediatamente após a liberação das partículas de ouro. Os embriões são colocados novamente em água artificial de lagoa, preferencialmente um embrião por placa, por um a três dias, até que a interferência por RNA ou a expressão ectópica sejam consideradas suficientes.

Durante este período, os embriões são mantidos em uma câmara escura à temperatura ambiente. Aqui está uma visualização de um ensaio de hibridização com ceto para narina, silenciamento de Mr.NA. Pode-se observar que, no embrião tratado, poucas células musculares não expressam terrina.

Esses músculos contêm partículas. É possível observar que, quando as partículas foram revestidas com RNA de fita dupla terrin, ocorre uma redução claramente visível da expressão de narin, a qual só acontece em células que contêm partículas, geralmente de uma a duas partículas por célula. Quando você reveste partículas com um plasmídeo que codifica GFP, obtém fluorescência em células neuronais quando elas param em seus núcleos com a pistola de capilar pneumática que utilizamos.

Nesta demonstração, foi possível entregar ambas as partículas às células em um pequeno volume localizado de embrião vivo sem causar danos detectáveis às células na área-alvo. Também mostramos como a pistola capilar nômade confere à técnica de entrega holística uma nova capacidade de ativar e inativar genes em uma região microscópica de um tecido confinado em três dimensões e direcionado com alta precisão, sem danos detectáveis ao tecido. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.